大肠杆菌高密度培养2014018093

大肠杆菌高密度培养

生物1401谢宇忱 2014018093

１ 大肠杆菌高密度培养的影响因素

１．１ 菌种

不同的E.coli菌株由于自身代谢系统的不同，在培养条件、对外界环境耐受能力等方面都存在着较大的差异。例如E.coli K系列菌株和E.coli B系列菌株均为较常用的培养菌株，进行了乙酸代谢研究，发现前者的乙酸积累仅为后者的1/4，菌体密度也高出25％。 １．２ 接种量

接种量会影响菌体在发酵罐中的生长速度。较大的接种量可以缩短菌体生长达到最高值的时间，这是因为种子液中含有大量胞外水解酶类，有利菌体对基质的快速充分利用，缩短生长延迟期。但是接种量过大也会使菌体生长过快，菌体生长持续的时间缩短，自溶也较快，反而影响后期的生长。 １．３ 培养基

高密度培养的目的是尽可能多地获得菌体生物量和表达产物，这就需要提供数倍于生物量的营养物质，才能满足菌体大量生长繁殖及分泌表达产物的需要。但基质中营养物质的浓度也不能太高，否则就会产生抑制效应，不利于高密度培养。

１．３．１ 碳源

不同微生物对碳源的需求各不相同，碳源的种类和浓度对菌体的生长代谢也有不同的影响。葡萄糖 E.coli发酵中最常用的碳源。但以葡萄糖作为碳源易产生代谢抑制物质———乙酸，研究表明以甘油代替葡萄糖作为E.coli生长的碳源可以减少乙酸的积累，更易达到高密度。在发酵过程中补加麦芽糖和甘油，菌体密度和产物量都提高了2.5倍。

１．３．２ 氮源

大量研究表明应对发酵过程中的氮源加以控制，氮源浓度过高对菌体的生长和产物的表达合成都可能产生负面影响。培养E.coli时常用氨水作为主要的氮源，在培养过程中以流加的方式加入培养液，既可用来充当氮源又可用来调节发酵液的ｐＨ值，但氨水加入过多会导致细胞的产率下降。

１．３．３ 微量元素

E.coli对钙、钴、铁、铝、锰、锡等微量元素的需求量虽然很小，但微量元素对微生物的生长及活性所起的作用不可忽视，在高密度培养时应在培养基中添加适量的微量元素。 １．４ 培养条件 １．４．１ 温度

温度对E.coli的生长繁殖有很大的影响E.coli的最适生长温度为37℃，但在近期的一些研究中，经常以低于37℃的温度来培养E.coli，当培养温度从37℃下降至30℃左右时，可使细胞的营养物摄入率和比生长速率减小，减少有害抑制产物的积累和代谢热的产生。

１．４．２ 溶氧

氧是一种难溶气体，常温常压下氧在纯水中的溶解度仅为７ｍｇ·Ｌ^－１。因此溶氧很容易成为E.coli高密度培养的限制因素，尤其是在高密度培养的后期，发酵液中菌体密度很大，耗氧量极大。在高密度培养时，可以通过提高发酵通气量、搅拌速度、通入纯氧等方法来控制溶氧；还可以通过使用氧溶解度高的载体来提高溶氧。

１．４．３ ｐＨ值

微生物一般能够在３～４个ｐＨ值单位的范围内生长，细菌最适生长ｐＨ值为６．５～７．５，在ｐＨ值５．０以下或８．５以上就不能生长。培养液中ｐＨ值的变化会影响细胞

内的ｐＨ值从而影响微生物的生长繁殖。另外菌体自身的生长代谢也会导致培养液中ｐＨ值的变化。发酵培养过程中通常利用稀氨水来调节发酵液的ｐＨ值，以便同时补充氮源。 １．５ 有害副产物

E.coli利用葡萄糖产生的主要有害物质是乙酸，尤其是在较大的比生长速率或供养不足时；但当E.coli在葡萄糖过量的条件下生长时，即使氧充足也会产生乙酸。通过提高乙酸利用率，优化培养基、降温培养、透析培养等方法都可以有效地降低乙酸的积累。

２ 大肠杆菌高密度培养的方法

E.coli高密度培养的方法主要是补料分批培养。补料分批培养是在分批培养过程中间歇或连续地补加新鲜培养基，以达到延长菌体生长期和控制培养过程的目的。补料方法分为非反馈补料和反馈补料。 ２．１ 非反馈补料

非反馈补料主要包括恒速补料、变速补料、指数补料等。 恒速补料是以恒定的速率流加限制性基质的碳源。随着发酵的进行，相对于培养液中的菌体来说，营养浓度是逐渐降低的，菌体的比生长速率也慢慢减小，但菌体能够得到持续的生长，培养液中菌体量在培养过程中是线性增加的。

变速补料是指在培养过程中，营养物质的补加速率以阶段性或线性等方式不断加快或减慢。当菌体浓度较高或菌体生长旺盛时，就加快补料速度，加入更多营养物促进细胞的生长繁殖从而实现高密度；反之，就减慢补料速度。

指数补料是一种简单而又有效的补料方式，它能使培养体系中营养物的浓度控制在较低的水平，可以有效地减少乙酸等有害代谢物的积累，使菌体密度以一定的比生长速率呈指数形式增加（比生长速率通常维持在０．１～０．３５ｈ^－１之间）。 ２．２ 反馈补料

反馈补料分为恒溶氧法、恒ｐＨ值法、ＣＥＲ（ＣＯ2排放率）法等。 恒ｐＨ值法应用最广泛，它是基于ｐＨ值恒定的反馈控制策略：当培养液中碳源耗尽时，菌体产生的ＮＨ4+浓度会增大，导致ｐＨ值上升。因此，可将某一ｐＨ值作为补料控制的临界值，当ｐＨ值大于该设定值时，开始补料，将底物浓度控制在合适的范围内。

反馈补料能够根据反馈的信息及时调整补料的速率和策略，但具有一定的滞后性，不能完全避免糖浓度的波动和代谢副产物的积累；而非反馈补料也存在不能根据发酵环境的变化和菌体生长的具体情况作出反馈调节的缺点。因此，如何结合各补料方法的优点同时摒弃其缺点，找到一种新的、更有效的补料方法成为研究的热点和突破点。

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