毕业论文文献综述
生物技术
海藻酸二氧化硅杂化凝胶固定降解对苯二甲酸微生物的研究
摘要：对苯二甲酸（PTA）是一种重要的化工原料，其生产废水严重污染环境，对水生生物的生长繁殖造成了影响。近年来大多数研究者利用微生物降解对苯二甲酸废水，本文阐述了采用海藻酸二氧化硅杂化凝胶，固定该菌的固定化条件的优化以及其降解对苯二甲酸的动力学研究。
关键词：海藻酸；二氧化硅；固定；对苯二甲酸；对苯二甲酸降解菌；动力学 1 引言
对苯二甲酸(Pure Terephthalic Acid ,简称 PTA，又称TA)是一种重要的石油化工产品 ,是生产聚酯纤维涤纶、塑料增塑剂、农药和染料等化工产品的原料或中间体[1]。每1tPTA的生产就会产生3~4m3的废水，其中PTA的含量高达1500mg/L。PTA具有一定毒性, 对水中微生物的再生有强抑制作用[2]。该类废水如直接排入自然环境中，将对水中鱼及微生物的生长、代谢带来严重的危害[3]。众多研究表明PTA可以被利用微生物分解，并可作为微生物唯一的碳源被其降解。利用微生物降解对苯二甲酸（PTA）可以解决由PTA引起的污染，不会浪费能量，节省资源，不会引起其他形式的污染。 2 对苯二甲酸降解菌的研究现状 2.1 降解对苯二甲酸的微生物
数十年来，科学家一直在研究微生物对对苯二甲酸的降解。小岩成次等[4]从土壤之中分离筛选得到七株细菌，能以邻苯二甲酸、间苯二甲酸或对苯二甲酸做为唯一碳源的培养基中进行生长。其中三株为棒杆菌，两株为碱杆菌属，另外两株为节杆菌属。北京大学的林稚兰等[5]从合成聚酯纤维涤纶工厂周围被对苯二甲酸粉尘污染的土壤中筛选出了99株细菌，其中17株经过24h的降解，能将初始浓度为200mg/L的对苯二甲酸溶液降解90%以上。南京大学的邹惠仙等[6]通过实验证明，从污泥中分离的假单胞菌及土壤天然菌体能降解PTA，并对这株假单胞菌对PTA的降解动力学研究，证明该菌的作用下，PTA的降解速度符合Michaelis-Menten公式，并测定了最适合温度，最佳pH以及不同温度浓度的降解速度，求出了假平衡常数Km以及各种温度的最大反应速度。 2.2 对苯二甲酸降解菌的实验室研究
用微生物降解对苯二甲酸一直是科技工作者的热门课题和难题，目前的研究成果很少，且均属于实验室阶段[7-12]。大多数是通过分离筛选菌株的方法，证明某些细菌能降
解PTA。其中一部分的实验还涉及到细菌粗酶的提取，并对该菌的酶进行酶促反应动力学进行了研究，张健飞等[13]证明菌株提取酶的的km较小，说明对PTA的亲和力较强，适于对PTA的催化降解。官宝红等[14]探究了对苯二甲酸降解菌的降解途径，证明PTA可以分为好氧降解和厌氧降解途径。
2.3海藻酸二氧化硅杂化凝胶固定化细胞技术在处理对苯二甲酸中的应用
固定化微生物细胞技术是利用物理或化学的手段将有利微生物细胞定位于现代的空间区域，并使其保持活性反复利用的方法[15]。固定化微生物技术处理废水与传统的悬浮生物处理法相比，具有处理效率高、稳定性强、能利用不易形成絮凝体的微生物和增殖速度慢的微生物、保持高效菌种、生物浓度高、耐冲击、污泥生成量少、固液分离效果好等特点[15]。
在常用的固定化载体中，多糖类海藻酸(Alginate,ALG)高分子水凝胶，和sol-gel二氧化硅(SiO2)应用较为广泛。其中，海藻酸具有极好的生物相容性和很强的亲水性，海藻酸凝胶包埋过程操作简便，条件温和，且具有较大的孔径。同样，sol-gel二氧化硅郭定华过程条件温和，机械强度好，稳定性强。然而由于海藻酸凝胶结构松散，细胞泄漏严重；sol-gel二氧化硅固定化过程的酸碱催化剂和醇类助溶剂对细胞活性影响较大，因此如果将海藻酸的柔性和二氧化硅的刚性相结合，兼顾两种载体的优点，则有可能为细胞创造出更为适宜的微环境[16]。 3 对苯二甲酸降解菌的培养与收集 3.1 培养基
用于分离纯化降解 PTA 细菌的培养基配方为：NH4Cl 1.0g/L，MgSO4 ·5H2O 0.25g/L，KH2PO4 3.0g/L，Na2HPO4 7g/L， NaCl 0.5g/L，PTA 1.0g/L，琼脂15g/L， pH 7.0[17]。这里采用此种培养基用于细菌的培养与保存，扩大化液体培养时，则不加琼脂。 3.1斜面种子活化
取斜面保藏菌株接种于新鲜斜面，30℃下恒温培养。 3.2种子培养
取1～2环活化的斜面种子接入装有100mL基础培养基的250mL三角瓶中， 30℃，140r/min的摇床振荡培养24h。 3.3 增殖培养
以1%的接种量将种子液接入装有100mL培养基的250mL三角瓶中，30℃，140r/min的摇床振荡培养48h。 3.4 菌体浓度测定
采用722型可见分光光度计测定，波长 600nm，以相应增殖培养基为空白。 3.5 菌体的收集
在离心管中加入30mL培养液，在转速为10000r/min的条件下离心分离10min，收集细胞。
3.6 降解率的测定
采用WFZ UV-2008H紫外可见分光光度计测定，波长240nm，以蒸馏水为空白对照。将测得的数值带入到对苯二甲酸的标准曲线中，计算出培养基中对苯二甲酸的残留量。根据公式（降解率=培养基中对苯二甲酸的配制浓度-培养基中对苯二甲酸的残留量/培养基中对苯二甲酸的配制浓度）计算出细菌的降解率。 4 细胞的固定
4.1 海藻酸凝胶固定化细胞
将干燥好的海藻酸溶解在蒸馏水中，浓度为2.5%（W/V）。4ml海藻酸溶液与装有100mL培养基的250mL三角瓶内培养48h的细胞离心，收集的细胞用1ml 0.05M，pH 7.0 Tris-HCl缓冲液混合均匀。将海藻酸和细胞的混合溶液用内径为0.7mm的10ml 一次性医用注射器滴加到20ml 0.2M CaCl2溶液中。所形成的凝胶颗粒在室温下凝胶化30mim后取出洗涤备用[16]。
4.2 海藻酸二氧化硅(ALG-SG)杂化凝胶固定化细胞
ALG-SG杂化凝胶固定化细胞过程与海藻酸凝胶固定化细胞过程类似。首先将二氧化硅胶体颗粒超声分散后，与溶解于1ml 0.05M，pH 7.0 Tris-HCl缓冲液的细胞混合12h，使细胞充分吸附在二氧化硅胶体上。然后将上述细胞-二氧化硅混合液与4ml浓度为2.5%的海藻酸溶液混合均匀，用内径为0.7mm的10ml 一次性医用注射器滴加到20ml 0.2M CaCl2溶液中，在室温下老化30min后取出洗涤备用。将二氧化硅的浓度自定义到每毫升海藻酸溶液中二氧化硅的掺杂量。 4.3 SiO2的掺杂量对固定化材料性质的影响
将浓度（W/V）为0%、0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%的SiO2掺杂入上述凝胶中，随机抽取其中20个凝胶颗粒，用压片法测定凝胶机械强度；采用电子显微镜查看颗粒内部；并用红外测定颗粒表面积。 5 微生物降解对苯二甲酸的动力学研究 5.1不同pH对TA降解率的影响
pH分别为6、7、8、9、10，浓度为0.1g/L的TA溶液，设平行试验测定pH对微生物降解对苯二甲酸的速度的影响，同时得到最佳pH范围。
5.2不同温度对TA降解率的影响
TA浓度均为0.1g/L，接种量相同，设平行及对照试验。共分七组置于4℃、10℃、20℃、30℃、33℃、35℃、40℃温度下培育，以测定温度对微生物降解TA速度的影响，同时得到最适温度。
5.3不同接种菌量对TA降解率的影响
TA浓度均为0.1g/L，取12瓶装有100ml培养液的250ml锥形瓶，接种相同菌液，培养48h，离心，收集细胞，以1/12份细胞为一个单位，分别包埋1/4、1/2、3/4、1、3/2、2个单位的细胞，同时游离细胞设置对照，以测定接种菌量对微生物降解TA的影响。
5.4各种温度下，TA初始浓度对微生物降解TA的影响
接种量相同，培养温度为4℃、10℃、20℃、30℃、33℃，初始浓度分别为50、100、200、400、600、1000mg/L，做平行试验及对照，测定各种温度下，TA初始浓度对微生物降解TA的影响。 5.5分析方法
间隔一定时间，自底物中取样，以4000r/min离心20min，取上层清液，稀释一定倍数，在240nm波长下，以底物为空白对照，测定吸光度，求出TA浓度。
参考文献
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海藻酸二氧化硅杂化凝胶固定降解对苯二甲酸微生物的研究【文献综述】
