半贴壁细胞系的传代培养实验方案
ECACC实验室手册（第4版）
默克带你走进半贴壁细胞系的传代培养的实验室。
目标
一些细胞系以混合群体（例如B95-8 - 狨猴）生长，其中一部分细胞不附着于组织培养瓶上并保持悬浮状态。因此，为了保持这种异质性，必须对附着细胞和悬浮细胞进行传代培养。
材料
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细胞培养基 — 预热到适当的温度（有关正确的培养基和温度，请参阅ECACC细胞系数据表。）
70％ (v/v) 乙醇无菌水溶液(793213) PBS，不含Ca2+ / Mg2+(D8537)
0.05% 胰蛋白酶 / EDTA，溶于HBSS中，不含Ca2+/Mg2+(T3924) 大豆胰蛋白酶抑制剂（T6522）或FBS 台盼蓝溶液 (T8154)
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设备
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个人防护装备（无菌手套、实验室外套、护目镜） 设置到适当温度的水浴 适当密封水平的生物安全柜 培养箱
预先标记的培养瓶 倒置相差显微镜 离心机 细胞计数板 马克笔 移液管 安瓿瓶架 纸巾
操作流程
1. 使用倒置相差显微镜观察培养物，以评估汇合度，并确认不存在细菌和真菌污染物。首
先轻轻敲打培养瓶，这样可以将细胞从培养瓶上分离开，并可避免胰蛋白酶消化步骤中因洗涤而导致的一些细胞损失。
2. 将含有非贴壁细胞的培养基转移到无菌离心管中保留。
3. 用不含Ca2+/Mg2+的PBS洗涤剩余的附着细胞，每25cm2的表面积加入1-2 mL。保留
洗涤物。
4. 用移液器将胰蛋白酶/EDTA按照1 mL/25cm2表面积加至经洗涤的单层细胞上。旋转烧
瓶以使胰蛋白酶覆盖单层。倒出多余的胰蛋白酶。 5. 将培养瓶放回到培养箱中，静置2-10分钟。
6. 使用倒置显微镜查看细胞，确保所有细胞都脱离并漂浮。可以轻拍烧瓶的侧面以使任何
剩余的贴壁细胞脱落。
7. 将细胞转移到保留有的用过的培养基和细胞的离心管中。 8. 将所有细胞悬浮液150 x g离心5分钟。
9. 弃上清，将细胞沉淀重悬于少量 (10-20 mL) 新鲜培养基中。对细胞进行计数。 10. 用移液器将所需数量的细胞转移到标记的新培养瓶中，使用新鲜培养基稀释至所需体积
（有关接种密度，请参阅ECACC细胞系数据表）。 11. 必要时每2-3天重复此过程。
要点
1. 尽管大多数细胞能够在仅有胰蛋白酶存在的情况下分离，但加入EDTA可以通过去除抑
制性的阳离子增强酶的活性。
2. 胰蛋白酶在血清存在的条件下会失活。因此，必须用不含Ca2+ / Mg2+的PBS洗涤单
层细胞，以从培养基中清除所有痕量的血清。反复升温至37 °C也会使胰蛋白酶失活。 3. 细胞接触蛋白酶/EDTA的时间应仅够分离细胞。长时间接触可能会损害细胞表面受体。
通常，与贴壁细胞系相比，半贴壁细胞系所需的胰蛋白酶接触时间更短。 4. 在将细胞接种到新瓶之前，应使用血清中和胰蛋白酶，否则细胞不会附着。
5. 还可以通过添加大豆胰蛋白酶抑制剂来中和胰蛋白酶，即向胰蛋白酶消化的细胞中加入
等体积的浓度为1 mg/ml的抑制剂。如上所述，然后将细胞离心，重悬于新鲜培养基中并计数。
6. 如果没有CO2培养箱，则向培养瓶充经过0.2 μm过滤器过滤的含有5％ CO2和95％空
气的气体1-2分钟。
图 1.半贴壁细胞系举子。冻融后24小时（A）和72小时（B）的B95-8细胞显示出半贴壁的成纤维细胞和淋巴母细胞形态。当细胞融合率达到80%时，应仔细监测和传代。
半贴壁细胞系的传代培养实验方案
