怀地黄中地黄苷D的提取工艺及不同炮制品含量的比较研究
摘 要：为建立怀地黄中地黄苷D的提取工艺，并比较不同炮制品中地黄苷D的含量，采用单因素实验法优选怀地黄中地黄苷D的提取工艺；采用高效液相色谱法测定怀地黄不同炮制品中地黄苷D的含量。结果表明： 怀地黄中地黄苷D的最佳提取工艺条件为60%甲醇加热回流提取2 h，该工艺稳定可行，地黄苷D提取率较高；生地黄中地黄苷D的含量为0.250%，比熟地黄（0.208%）高。
关键词：怀地黄；地黄苷D；高效液相色谱
中图分类号：S567.23文献标识号：A文章编号：1001-4942（2016）05-0127-04
Abstract To establish the extraction process of rehmannioside D in Radx Rehmanniae， and compare its content in different processed products， the single factor experiments were conducted to optimize the extraction process， and the HPLC method was adopted to detect the
rehmannioside D content. The results showed that the optimal extraction conditions were heating reflux extraction for 2 hours with 60% of methanol， which was stable and reliable with higher extraction rate. The content of rehmannioside D in Radix
Rehmanniae was 0.250%， which was higher than that in Radix Rehmanniae Praeparata （0.208%）.
Key words Radix Rehmanniae； Rehmannioside D； High performance liquid chromatography （HPLC）
地黄为玄参科植物地黄（Rehmannia glutinosa Libosch） 的新鲜或干燥块根。主产于河南焦作地区温县、武陟（古怀庆府） 等地的道地药材称为怀地黄[1]，现代研究表明其品质优于其他地黄[2，3]。生地黄能够清热凉血、养阴生津， 熟地黄具有滋阴补血， 益精填髓的功效[4] 。关于地黄的化学成分已有大量研究[ 5，6]。地黄苷D为地黄的主要有效成分，且炮制前后其含量相对稳定，在生地黄、熟地黄中含量均较高[7]，故测定其含量对考察地黄药材质量具有一定意义。 本试验采用单因素实验法优选怀地黄中地黄苷D的提取工艺，用高效液相色谱法对怀地黄不同炮制品中主要有效成分地黄苷D进行了含量测定，比较不同加工炮制方法对其含量的影响，为怀地黄中地黄苷D的高效提取及合理利用提供理论依据。 1 材料与方法 1.1 材料
生地黄，经鉴定来源为Rehmannia glutinosa Libosch的块根。 1.2 试剂
甲醇（分析纯），纯净水，乙腈（色谱纯），地黄苷D标准品（上海源叶生物科技有限公司，CAS号：81720-08-3）。 1.3 仪器
高效液相色谱分析仪（安捷伦1200型），KQ-500E型超声波清洗器，BSA224赛多利斯电子天平，101-0A型数显式电热恒温干燥箱，DLSB-ZC型低温循环（真空）泵，SHB-Ⅲ循环水式多用真空泵，高速万能粉碎机QE-300克，HH-6数显恒温水浴锅，KDM型调温电热套，SHANGHAI滤膜（0.45 μm）。
1.4 样品的制备
1.4.1 生地黄 取道地生地黄，烘干至八成干，切丁，60℃恒温干燥12 h，粉碎，过4号筛。
1.4.2 熟地黄 取净生地黄，置笼屉内蒸至内外黑润，取出，晒至八成干，切丁，60℃恒温干燥12 h，粉碎，过4号筛。
1.5 供试品溶液的制备
精密称取约1.0 g生地黄粗粉，置500 mL圆底烧瓶中，加入60%甲醇溶液100 mL，加热回流提取2 h，冷却，补足失重，抽滤，精密量取抽滤液10 mL，90℃水浴浓缩至近干，浓缩物用10%乙腈溶液溶解，定容至50 mL。0.45 μm微孔滤膜滤过，得供试品溶液。 1.6 标准品溶液的制备
精密称取地黄苷D标准品，10%乙腈溶解，定容至50 mL，得0.088 mg/mL标准品溶液。 1.7 色谱条件
色谱柱Aglient TC-C18（2）（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相乙腈-水（4∶96）；流速1.0 mL/min；检测波长205 nm；柱温25℃。 2 结果与分析
2.1 单因素法优选怀地黄地黄苷D提取工艺
2.1.1 提取溶剂的考察 精密称取生地黄粗粉4份，各约1.0 g，置于500 mL圆底烧瓶中，分别加入50%、60%、70%、80%甲醇溶液100 mL，按1.5方法制备供试品溶液，进样，测地黄苷D峰面积。经考察选择60%甲醇溶液作为提取溶剂（表1）。
2.1.2 提取方法的考察 精密称取生地黄粗粉2份，各约1.0 g，置于500 mL圆底烧瓶和具塞锥形瓶中，60%甲醇溶液作为提取溶剂，分别采用加热回流2 h、50℃超声30 min的方法提取，测地黄苷D峰面积。经考察选择加热回流的提取方法（表2）。 2.1.3 提取时间的考察 精密称取生地黄粗粉3份，各约1.0 g，置于500 mL圆底烧瓶中，60%甲醇溶液作为提取溶剂，加热回流提取1.5、2.0、2.5 h，测地黄苷D峰面积。经考察选择加热回流提取时间为2 h（表3）。 2.2 方法学考察
2.2.1 线性关系的考察 精密吸取标准品溶液0.1、0.5、1.0、1.5、2.0 mL，用10%乙腈定容至10 mL，制成系列对照品溶液。分别进样20 μL，以峰面积为横坐标，标准品含量（mg/mL）为纵坐标进行回归，得回归方程为Y=1.371×10-5X-2.546×10-4，在0.00088～0.0176 mg/mL范围内呈良好线性关系。
2.2.2 精密度试验 取标准品溶液20 μL，重复进样5次，测定峰面积RSD=1.27%，表明仪器精密度良好。 2.2.3 稳定性试验 精密称取生地黄粗粉约1.0 g，按照1.5方法配制供试品溶液，在配置后0、2、4、6、8、12 h分别进样，每次进样20 μL，计算得RSD=1.6%，表明生地黄供试品溶液在12 h内稳定性良好。
2.2.4 重复性试验 精密称取生地黄粗粉5份，各约1.0 g，按1.5方法配制供试品溶液，分别进样20 μL，计算得RSD=1.9%，表明该方法重复性良好。
2.2.5 回收率试验 精密称取6份已知地黄苷D含量的生地黄粗粉，各约1.0 g，分别精密加入不同浓度的标准品溶液，按供试品溶液制备方法进行提取，以1.7色谱条件进行测定，测得地黄苷D的平均回收率为99.4%，RSD=2.0%（表4）。 2.3 怀地黄不同炮制品中地黄苷D的含量测定 准确量取生地黄、熟地黄供试品溶液，以1.7色谱条件进行测定，记录生地黄及熟地黄中地黄苷D的峰面积，按标
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