南方农业学报JournalofSouthernAgriculture2018，49（11）：2304-2310·2304·南方农业学报ISSN2095-1191；CODENNNXAABhttp://www.nfnyxb.com49卷DOI：10.3969/j.issn.2095-1191.2018.11.27尼罗罗非鱼Lck多克隆抗体的制备及鉴定
张永德，林
勇，冯鹏霏，陈
忠，杜雪松，黄
姻，潘传燕，罗洪林*
530021）
（广西水产科学研究院/广西水产遗传育种与健康养殖重点实验室，南宁
摘要：【目的】制备及鉴定尼罗罗非鱼淋巴细胞特异性蛋白酪氨酸激酶（Lck）多克隆抗体，为深入研究罗非鱼Lck蛋白功能及其免疫机制打下基础。【方法】采用无缝克隆技术构建重组质粒pET-B2m-Lck，然后转入大肠杆菌B21（DH3）中进行诱导表达；经Ni-NTA树脂层析柱纯化后，以纯化的融合蛋白免疫日本大耳白兔制备Lck多克隆抗体，并采用Westernblotting和ELISA检测多克隆抗体的特异性和免疫效价。【结果】尼罗罗非鱼Lck蛋白的亲水性均值（GRAVY）为-0.454，属于亲水性蛋白，具有较丰富且分布均匀的潜在抗原表位位点，无典型的跨膜区。经原核载体诱导表达获得的融合蛋白分子量约67.0kD，主要以包涵体形式存在。免疫日本大耳白兔后可获得效价为1∶256000的Lck多克隆抗体，且该多克隆抗体能特异性识别Lck蛋白。经ProteinG亲和层析柱纯化的抗体浓度在10mg/mL以上，纯度约95%，抗体纯化效果良好。【结论】经原核载体诱导表达获得的尼罗罗非鱼Lck融合蛋白具有良好的免疫原性，其免疫日本大耳白兔后获得的多克隆抗体具有高效价和特异性，可用于细菌感染罗非鱼后机体免疫机制的研究。
关键词：尼罗罗非鱼；淋巴细胞特异性蛋白酪氨酸激酶（Lck）；原核表达；包涵体；多克隆抗体中图分类号：S965.125
文献标志码：A
文章编号：2095-1191（2018）11-2304-07
PreparationandidentificationofLckpolyclonal
antibodyinNiletilapia
ZHANGYong-de，LINYong，FENGPeng-fei，CHENZhong，DUXue-song，
HUANGYin，PANChuan-yan，LUOHong-lin*
（GuangxiAcademyofFisherySciences/GuangxiKeyLaboratoryofAquaticGeneticBreedingand
HealthyAquaculture，Nanning530021，China）
Abstract：【Objective】PreparationandidentificationofNiletilapialymphocyte-specificproteintyrosinekinase（Lck）
polyclonalantibodieswerecarriedouttolayafoundationforfurtherresearchonthefunctionandimmunemechanismofLckproteinintilapia.【Method】TherecombinantplasmidpET-B2m-Lckwasconstructedwithseamlesscloningtechnology，andthenwastransferredintoEscherichiacolistrainB21（DH3）forexpressioninduction.AfterpurificationbyNi-NTAchromatographycolumn，LckpolyclonalantibodywaspreparedbyimmunizingJapanesebigearrabbitswithpurifiedfu-sionprotein，andthespecificityandimmunitytiterofpolyclonalantibodyweredetectedbyWesternblottingandELISA.【Result】Theaveragehydrophilicity（GRAVY）ofNiletilapiaLckproteinwas-0.454，whichwasahydrophilicprotein.Lckproteinhadrichandwell-distributedpotentialepitopesitewithnotypicaltransmembraneregion.Thefusionproteinobtainedbytheexpressioninductionoftheprokaryoticvectorhadamolecularweightofabout67.0kD，andmainlyexistedintheformofinclusionbody.AfterimmunizingJapanesebigearrabbits，aLckpolyclonalantibodywithatiterof1∶256000wasobtained，whichcouldspecificallyrecognizetheLckprotein.TheconcentrationoftheantibodypurifiedbyProteinGaffinitychromatographycolumnwasabove10mg/mL，thepuritywasabout95%，andtheantibodywaswellpurified.【Conclusion】TheLckfusionproteinofNiletilapiaobtainedbyprokaryoticexpressioninductionhasgoodimmu-nogenicity，andthepolyclonalantibodyobtainedafterimmunitytobigearrabbithashighefficiencyandspecificity，whichcanbeusedinthestudyoftheorganismimmunemechanismafterbacterialinfectionoftilapia.
Keywords：Niletilapia；lymphocyte-specificproteintyrosinekinase（Lck）；prokaryoticexpression；inclusionbody；polyclonalantibody
收稿日期：2018-05-30基金项目：国家自然科学基金项目（31760765，31372553）；国家现代农业产业技术体系广西创新团队建设项目（nycytxgxcxtd-08）；
广西自然科学基金项目（2015GXNSFAA139068）
作者简介：*为通讯作者，罗洪林（1978-），博士，副研究员，主要从事分子生物学与免疫学研究工作，E-mail：lhl200296@126.com。
张永德（1977-），副研究员，主要从事水产动物遗传育种研究工作，E-mail：yondar@126.com
11期张永德等：尼罗罗非鱼Lck多克隆抗体的制备及鉴定
·2305·0引言
【研究意义】淋巴细胞特异性蛋白酪氨酸激酶（Lymphocyte-specificproteintyrosinekinase，Lck）是Src蛋白激酶家族的成员之一，在胸腺细胞发育的各阶段均有表达（邓英辉等，2006）。Lck包含N-端膜锚定区（SH4结构域）、独特的结构域、Src-同源3（SH3）结构域、SH2结构域、催化激酶结构域和C-端尾端（Ngoenkametal.，2018），在T淋巴细胞抗原受体（TCR）介导的信号转运过程中发挥关键作用。TCR与抗原肽结合可引起Lck与T淋巴细胞共同与CD4+和CD8+相互作用，进而通过激活白细胞介素-2（IL-2）诱导T淋巴细胞增殖和分化（PalaciosandWeiss，2004；Salmondetal.，2009；Smith-Garvinetal.，2009），最终引起酪氨酸激酶Zap-70的募集与激活（Kaneetal.，2000）。激活的Zap-70分子自磷酸化并为其他信号分子如膜衔接蛋白LAT（用于激活T淋巴细胞的接头）提供停靠位点，后者又募集并激活其他蛋白以启动蛋白激酶C和MAP激酶途径，该途径是T淋巴细胞增殖、分化及其效应功能的基础（Sommersetal.，2004）。罗非鱼是我国重要的水产养殖品种，但近年来链球菌病等细菌性疾病给罗非鱼养殖业带来巨大经济损失，严重阻碍其产业的可持续健康发展（黎小正等，2013；Lietal.，2015；罗伟等，2018）。由于目前对病原入侵罗非鱼后其免疫反应的认识非常有限，且有关Lck在罗非鱼免疫系统中的作用尚不清楚。因此，构建罗非鱼Lck表达载体并进行诱导表达及多克隆抗体制备，对进一步了解Lck的功能乃至鱼类免疫具有重要意义。【前人研究进展】目前已克隆鉴定出Lck基因的硬骨鱼类有日本河豚（Takifugurubripes）（Brenneretal.，2002）、斑马鱼（Daniorerio）（Langenauetal.，2004）、日本银鲫（Carassiusauratuslangsdorfii）（Arakietal.，2007）、大菱鲆（Scophthal-musmaximus）（Chenetal.，2007）、虹鳟鱼（Oncor-hynchusmykiss）（Laingetal.，2007）、大西洋比目鱼（Hippoglossushippoglossus）（?verg?rdetal.，2010）、鲑鱼（Salmosalar）（Leongetal.，2010）、日本鳗（An-guillajaponica）（Kawabeetal.，2012）、罗非鱼（Oreo-chromisniloticus）（Ganetal.，2015）和红笛鲷（Lutja-nussanguineus）（Huangetal.，2016）等，但针对硬骨鱼Lck的研究主要集中在基因克隆及其组织表达分布上，虽然有研究显示在T淋巴细胞有丝分裂原（PHA和PMA）的刺激下Lck基因表达增强（Laingetal.，2007），但对Lck在抗细菌侵袭免疫应答中的作用了解非常有限。【本研究切入点】尽管目前已有针对尼罗罗非鱼Lck基因进行克隆与表达分析的研究
（Ganetal.，2015），但Lck在罗非鱼免疫反应中的具体作用尚不清楚。【拟解决的关键问题】对尼罗罗非鱼Lck基因进行原核表达，并通过免疫日本大耳白兔制备抗罗非鱼Lck特异性多克隆抗体，以期为深入研究罗非鱼Lck蛋白功能及其免疫机制打下基础。
1材料与方法
1.1
试验材料
重组质粒pET-B2m（由pET-28a改造获得）、表达宿主大肠杆菌B21（DH3）购自武汉金开瑞生物工程有限公司，T4DNA连接酶、TaqDNA聚合酶、蛋白Marker、限制性内切酶BamHI和SalI购自美国Fer-mentas公司，IPTG购自德国Merck公司，弗式完全佐剂和弗氏不完全佐剂购自美国Sigma公司，PVDF膜购自美国ThermoFisher公司，羊抗兔-HRP抗体购自美国Jackson公司，DNA回收试剂盒、质粒提取试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司，亲和层析柱料购自美国GEHealthcare公司。1.2试验方法
1.2.1蛋白质结构分析及抗原性预测采用在线分析工具ExPASy中的ProtScale（https://web.expasy.org/protscale/）预测Lck蛋白的亲/疏水性，TMHMMserverv.2.0（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/）对Lck蛋白序列进行跨膜区预测；使用Protean中的Jameson-Wolf方法对Lck蛋白的抗原指数等进行预测分析。
1.2.2目的基因扩增根据尼罗罗非鱼Lck基因序列（NCBI登录号KM058084），利用PrimerPremier5.0设计PCR扩增引物，上游引物P1：5'-ATGGGTTGTAATTGCGGTTGTAATTGC-3'，下游引物P2：5'-TTCTTGATACTGACGTTTCTTGATACTGACGT-3'。以合成的尼罗罗非鱼Lck基因序列为模板进行PCR扩增，扩增程序：94℃预变性4min；94℃45s，52℃45s，72℃45s，进行28个循环；72℃延伸10min。PCR扩增产物以1.2%琼脂糖凝胶电泳检测并进行切胶回收。
1.2.3原核表达质粒构建以BamHⅠ和SalⅠ双酶切pET-B2m载体，采用无缝克隆技术构建重组质粒pET-B2m-Lck，然后转入大肠杆菌B21（DH3）；筛选阳性克隆，提取质粒后进行PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳检测，并送至生工生物工程（上海）股份有限公司测序。测序结果采用DNASTARMegAlign进行比对分析。
1.2.4目的蛋白小量表达将测序正确的重组质粒转入大肠杆菌B21（DH3），取30.0μL过夜培养菌
·2306·南方农业学报49卷液接入3.0mLLB培养基中，37℃振荡培养至OD600=0.6。取部分菌液作为对照组，剩余菌液加入IPTG诱导剂至终浓度0.5mmol/L，对照菌液与诱导菌液继续37℃振荡培养3h；取1.0mL菌体经12000×g离心30s，收获沉淀，用100.0μL的1%SDS进行重悬，混匀。12000×g离心10min，收集上清液进行SDS-PAGE检测分析。
1.2.5目的蛋白表达与破菌检测取2.0mL过夜培养菌液加入到2000.0mL的LB培养基中，37℃振荡培养至OD600约等于0.6；加入IPTG诱导剂至终浓度0.5mmol/L，30℃继续振荡培养3h。收集发酵液，6000×g离心10min，收集菌体悬浮于40.0mL预冷的NTA-0缓冲液中，冰浴超声波破碎细菌，4℃下20000×g离心30min，收集上清液及沉淀。取少量样品进行SDS-PAGE检测分析。
1.2.6包涵体蛋白纯化将收集的沉淀加入到Ni-NTA树脂层析柱中，收集穿柱液体。以10倍柱床体积的NTA-0、NTA-20、NTA-60、NTA-200、NTA-500Buffer进行洗脱，收集各洗脱峰，取少量洗脱液进行SDS-PAGE检测分析。纯度达到要求的组分置于透析袋中，4℃下以1×PBS进行透析，最后4℃超滤浓缩透析产物。
1.2.7多克隆抗体制备和鉴定将纯化的融合蛋白与等容积弗氏完全佐剂乳化后，按500μg/只的剂量免疫2只日本大耳白兔，皮下多点注射。每只兔子免疫5~6次，每次免疫间隔14d，并检测免疫效价，待抗体表达恒定后，采血分离血清，-20℃保存备用。1.2.8免疫效价ELISA检测以Lck融合蛋白为抗原（2μg/mL），按100μL/孔加入到96孔板中进行抗原包被，4℃过夜；以2%卵清蛋白（OVA）于室温封闭30min，将待检血清按1∶2000、1∶4000、1∶8000进行二倍梯度稀释至1∶8192000，然后各取100.0μL加入96孔板，以空白血清为阴性对照。37℃温育1h后，加入HRP标记的羊抗兔IgG（1∶5000），100.0μL/孔，37℃温育45min；洗涤后加入TMB显色液（100.0μL）显色20min，以酶标仪测定OD450。阳性反应的
最大稀释度即为待测样品效价。
1.2.9Westernblotting检测分别取25和10ng纯化融合蛋白进行SDS-PAGE检测分析，200mA湿法转PVDF膜，然后在37℃下以封闭液封闭2h。加入兔抗血清（稀释度体积比1∶1000），37℃下摇床孵育1h。经洗涤后加入羊抗兔-HRP二抗（1∶10000倍体积稀释），37℃孵育1h，取等体积的ECL试剂A液、B液混合滴于PVDF膜正面，于暗室反应2min，取出胶片立即浸入显影液中显色1min，浸入定影液中定影1min，晾干，标定Marker后，拍照分析Lck抗血清的特异性。
1.2.10抗体纯化采用ProteinG亲和层析柱进行抗体纯化。将收集的抗血清与等体积2×PBS混合后上样，用10倍柱体积以上的PBS进行洗涤，至流出液无蛋白检出，加入2倍柱体积的0.1mol/L柠檬酸（pH2.7）洗脱，收集洗脱产物，测定OD280估算抗体浓度；以1mol/LTris调节洗脱产物pH至中性，采用10kD超滤管将样品浓缩至所需体积，纯化浓缩后的抗体经稀释后进行SDS-PAGE检测分析，-20℃保存备用。
2结果与分析
Lck蛋白亲/疏水性及跨膜区分析结果
Lck基因编码蛋白由501个氨基酸组成，亲/疏水性预测结果显示，Lck蛋白平均疏水性为-0.454，序列中含有较多的亲水性氨基酸，亲水性区段主要为第4~24、26~44、46~54、66~95、99~107、116~132、161~186、197~209、215~248、256~266、248~294、311~319、322~330、348~360、382~397、432~461、469~483和492~501位氨基酸（图1），序列亲水性较强。疏水性氨基酸［丙氨酸（Ala）、半胱氨酸（Cys）、异亮氨酸（Ile）、亮氨酸（Leu）、蛋氨酸（Met）、苯丙氨酸（Phe）和缬氨酸（Val）］分别占编码氨基酸的5.19%、2.40%、5.99%、8.38%、3.19%、3.59%和5.39%。跨膜区分析结果显示，Lck蛋白无典型的跨膜区，501个氨基酸均位于细胞膜表面，降低了跨膜区疏水性氨基酸对蛋白折叠的影响，易于表达和纯化。2.1
Fig.1
图1尼罗罗非鱼Lck蛋白的亲/疏水性预测分析结果
Hydrophilicity/hydrophobicitypredictionanalysisofNiletilapiaLckprotein
___________尼罗罗非鱼Lck多克隆抗体的制备及鉴定___________
