谷胱甘肽转硫酶的制备及动力学研究
摘要：谷胱甘肽转硫酶(Glutathione S-transferases)简称GSTs，广泛存在于动物和人体的各种组织，哺乳动物肝脏中含量最高约占肝可溶性蛋白的10%。GST是机体内一组具有重要解毒作用的同工酶家族，均为由两个亚基组成的二聚体相对分子质量为45 000—49 000各同工酶的等电点不同多为碱性同工酶。GST参与芳香环氧化物、过氧化物和卤化物的解毒作用，GST催化这些带有亲电中心的疏水化合物与还原型谷胱甘肽GSH的亲核基团。本实验采用亲和层析法制备谷胱甘肽转硫酶，并测定该酶活力,米氏常数和最大反应速度并用考马斯亮蓝法测定蛋白质含量，计算比活力。
关键词：GSTs，亲和层析，酶活力，米氏常数，最大反应速度，比活力
一、前言
1.1 谷胱甘肽转硫酶简介
谷胱甘肽转硫酶（Glutathione S-transferases）简称GSTs，广泛存在于动物和人体的各种组织，哺乳动物肝脏中含量约占肝可溶性蛋白的10%。GST是机体内一组具有重要解毒作用的同工酶家族，多为碱性同工酶，其解毒功能主要有两方面，第一， GST参与芳香环氧化物、过氧化物和卤化物的解毒作用，GST催化这些带有亲电中心的疏水化合物与还原型谷胱甘肽GSH的亲核基团GS反应中和它们的亲电部位使产物水溶性增加，经过一系列代谢过程，最后产物为巯基尿酸，被排出体外，从而达到解毒目的。第二，GST还能共价或非共价地与非底物配基以及多种疏水化合物结合，具有结合蛋白的解毒功能。 1.2 亲和层析原理
亲和层析的方法是根据具有亲和力的生物分子间可逆地结合和解离的原理建立和发展起来的。将一对能可逆结合和解离生物分子的一方作为配基，与具有大孔径、亲水性的固相载体相偶联，制成专一的亲和吸附剂，当被分离物随着流动相经过亲和吸附剂时，亲和吸附剂上的配基就有选择地吸附待分离物质，通过解吸附使待分离物质得以纯化。亲和层析法分离生物大分子示意图：
1.3 测定Km 和V的原理
Km和最大反应速度V是酶的特征常数，不同酶的Km和 V不同，受底物、pH、温度、离子强度等因素的影响。 米氏方程：
式中，v为反应初速[μmol/(L?min)]，V（或Vmax）为最大反应速度[μmol/(L?min)]，[S]为底物浓度(mol/L)，Km为米氏常数。Km可近似地反映酶与底物的亲和力大小：Km大，表明亲和力小；反之Km小，表明亲和力大。
将米氏方程的形式加以改变，可以得到几种方程形式，在特定条件下测得不同底物浓度[S]时相应的初速度v，用作图法测定Km和V。米氏方程是从单底物酶促反应推导出来的，
但实际上这种反应很少。在多底物反应中，如果只有一种底物浓度发生变化，其他底物浓度保持不变，那么就可以将它看成单底物反应，利用米氏方程的几种形式测定Km和V值。
测定Km和V图解法
（a）双倒数作图法；（b）Hanes-Woolf作图法；（c）Eadie-Hofstee作图法；
（d）Eisenthal和Cornish-Bowden作图法；
利用米氏方程测定Km和V可以采用终止反应法，是在酶和底物反应达到预定的时间（本实验反应时间采用1min）时，立即加入强酸使酶变性，终止酶促反应，在这段反应时间里产物的生成量基本呈线性增加，用这段反应时间内的平均速度代替反应初速度，利用作图法，
通过横截距和纵截距可以很方便地求出Km和V。 1.4考马斯亮蓝G-250染色法实验原理
考马斯亮蓝G-250Coomassie brilliant blue G-250，CBG）测定蛋白质含量属于一种染料结合法。CBG像指示剂，会在不同的酸碱度下变色：在酸性下是茶色，在中性下为蓝色。当结合蛋白质后，因为蛋白质会为CBG提供一个较为中性的环境，因此会变成蓝色。游离状态考马斯亮蓝G-250的最大光吸收在465nm，CBG-蛋白质结合物最大光吸收在595nm。在一定的蛋白质浓度范围内（10-1000ug/ml），CBG-蛋白质结合物的OD595nm值与蛋白质含量成正比，故可用分光光度法进行蛋白质的定量测。 二、材料和仪器
2.1 材料：新鲜（冷冻）动物肝脏 2.2 试剂：
Sepharose 4B；环氧氯丙烷；二氧六环；
缓冲液A：0.025mol/L磷酸盐缓冲液，pH7.4，含3mmol/L二硫苏糖醇（DTT），1mmol/L EDTA，0.2mol/L NaCl；
缓冲液B：0.025mol/L磷酸盐缓冲液，pH7.4，含3mmol/L GSH，2mmol/L DTT； 注：根据酶的性质在分离纯化过程中需要加入适量的金属鳌合剂、还原剂等，以保持酶的活性。
CDNB、GSH(60mmol/L)、酶、TCA （测定Km和V 时使用）； 酒石酸钾钠、硫酸铜、磷钼酸和磷钨酸。 2.3 仪器
分光光度计、层析柱、紫外检测仪、比色杯、秒表、加样器 (200μL)、1mL注射器（塑料）、秒表（测定Km和V 时使用）。 三、实验方法
3.1 亲和层析介质Sepharose 4B-GSH的制备：
活化 称取10g Sepharose 4B，分别用100mL去离子水、0.5mol/L NaCl、去离子水淋洗，加入6.5mL 2mol/LNaOH、15 mL56%二氧六环和1.5mL 环氧氯丙烷，45℃恒温水浴摇动（160r/min），活化2-3h后，用100mL去离子水洗去活化剂。
偶联 0.4 g GSH 溶于10mL去离子水中，用1mol/LNaOH调节pH7.6，将其加入凝胶中，密闭，37℃恒温水浴摇动（60r/min），偶联24ｈ后，分别用100mL去离子水、0.5mol/L NaCl的0.1mol/L乙酸缓冲液（pH4.5）、去离子水淋洗。残余的活化基团用40mL 1mol/L乙
醇胺封闭过夜，用100mL去离子水淋洗，得到亲和层析介质GSH－Sepharose。
装柱 柱床体积约4-6mL（柱高约2-3cm），连接蛋白监测系统，用Buffer A平衡（约10-20mL），至记录仪基线平稳。 3.2 上柱样品的准备：
(1) 按照两组4g动物肝脏，剪碎，加入约10倍组织重的Buffer A，用组织捣碎机匀浆。 (2) 匀浆液先用低速离心机离心10min，弃沉淀，上清再次离心（4℃，100 000g，40min），弃沉淀，上清液用滤纸过滤，收集滤液。 3.3 亲和层析柱分离GST：
(1) 上柱：将滤液上柱，流速约4-5秒1滴。
(2) 平衡：用Buffer A洗去杂蛋白至柱中介质变白，记录仪回到基线。
(3) 洗脱：用Buffer B洗脱，流速约4-5秒1滴，收集洗脱峰（约5mL），此峰即为GST吸收峰。
亲和层析法分离GST示意图 3.4酶活力的测定
调好紫外分光光度计，使其处于使用状态。取两个比色杯，分别加入磷酸盐缓冲液 、底物CDNB和GSH（60mmol/L），混匀。加样按下表：
0.1mol/L 磷酸盐缓冲液(pH6.5) 60mmol/L CDNB 60mmol/L GSH 混匀，放入分光光度计校零 酶液 0 15μL 加入酶同时按“run”，立即混匀，进行反应 （1）两个比色杯分别加入PB 、底物CDNB和GSH（60mmol/L），混匀； （2）以含参比溶液（不加酶的溶液）的比色皿调零；
（3）在另一比色皿中加入酶后，立即混匀，开始计时，放入分光光度计中；
空白比色杯 2.9mL 50μL 50μL 测定比色杯 2.885mL 50μL 50μL （4）每隔30s记录吸光度，共反应3~5min的。 3.5酶比活力的测定（考马斯亮蓝染色法）
制作标准曲线：取6支试管，依次分别加入0、0.10、0.20、 0.30、0.40、0.50ml的牛血清蛋白溶液，用水补足到0.5ml，每管均再加5ml染色液，立即摇匀，置室温下放置5分钟。然后测各管的OD595nm值，绘制标准曲线。制作标准曲线加样表： 编号 标准蛋白 （ml） 水(ml) 1 0.0 0.5 2 0.1 0.4 0.05 5 3 0.2 0.3 0.1 5 4 0.3 0.2 0.15 5 5 0.4 0.1 0.2 5 6 0.5 0.0 0.25 5 x 5 酶液 0.5 浓度0.0 (mg/ml) 染色液(ml) 5 OD值 （595nm） 3.6 Km和V的测
取6支试管，按下表依次加入CDNB、GSH（2mmol/L）、PB后，加入酶，同时用秒表计时，立即混匀，静置，1分钟时加入50%的TCA，混匀，终止反应。 2mmol/L GSH/mL 60mmol/L CDNB/μL 0.1mol/L PB/mL 酶液/μL ΔA340nm/min 0 0 50 2.85 15 0 1 0.15 50 2.70 15 0.073 2 0.30 50 2.55 15 0.129 3 0.60 50 2.25 15 0.130 4 1.20 50 1.65 15 0.144 5 2.40 50 0.45 15 0.159 反应1min时立即加入50%的TCA 100μL，混匀 调好分光光度计，空白同酶活性测定，用0试管溶液放在“1”位上校零，测定其他各管的吸光值。 四 结果与分析 4.1 实验结果
4.1.1亲和层析分离GST记录图
4.1.2 酶活力测定结果
洗脱
平衡
谷胱甘肽转硫酶 作业
