基因克隆与表达研究进展
周莎莎
【摘 要】基因的表达和调控是植物基因工程研究的中心内容之一,从基因克隆方法、克隆栽体的构建、瞬时表达分析、报告基因的选择以及基因表达量分析的方法5个方面对植物基因克隆与表达的研究进展进行了综述. 【期刊名称】《现代农业科技》 【年(卷),期】2008(000)022 【总页数】3页(P280-281,284)
【关键词】基因表达;基因克隆;表达量分析;Northern杂交 【作 者】周莎莎
【作者单位】南昌大学生命科学学院,江西南昌,330031 【正文语种】中 文 【中图分类】农业科学
工作研究《现代农业科技》 2008 年第 22 期基因克隆与 表达研究进 展周莎莎（南 昌大学生命科学学院，江两南昌 330031 ）摘要 基 因的表达和调控是植物基 因工程研究 的 中心 内容之一，从基 因克 隆 方 法 、 克隆栽体 的 构 建 、瞬 时表达 分析 、报告基 因的 选择以及基 因表达量分析 的方 法 5 个方 面 对植物基 因克 隆与表达 的研究进展进行 了综 述 。关键词 基 因表达 ：基 因克隆 ；表达量分析 ；Northem 杂交中图分类号S785 文献标识码 A文章编号1007-5739(2008)22-0280-02植物的生长发育和生命周期是不 同的基因在时 间和空
间上 有序 表达的结果 。基因 的表达调控受 多种内外 因子 的 影响。根据基因表达性质可将其分为 2 大类 ：一是瞬时调控 或称可逆性调控 ，包括某种底物或激素水平升降和细胞 周 期不 同阶段 中酶活性和浓度的调节 ；二是发育调控或称不 可逆调控 ，它 决定了 细胞 生长 、分化和发育 的全部进程 。根 据基因调控在 同一 事件 中发生 的先后次序 ， 又可将其 分为 转录水平调控 、转录后水平调控 、翻译水平调控及蛋 白质加 工水平调控等。植物基因调控主要是在转录水平上进行的 ， 受多种顺式作用元件和反式作用 因子的相互协调作用 的影 响 。植物基因启动子是重要的顺式作用元件 ，是位于结构基 因5’端上 游 区 的 DNA 序列 ，能指导全酶与 模版 的正确结合 ， 活化 RNA 聚合酶 ，使之具有起始特异性转录的形式 ，并决定转录的方向和效率以及所使用 的 RNA 聚合酶类型 ，是 转录调控 的中心 。 因此 ，植物基 因启动子 的克隆 ，对研究植 物基因表达调控和构建表达载体至关重要 。 1 基 因克隆方法 通过对已发表的大豆基因的克隆方法进行比较分析后发现 ，其克隆策略可概括为 2 种 ：一种是用 已知克隆作为探针筛选 cDNA或 gDNA 文库 ，从而获得所需的靶基因序列 ，然后再选 择合适 的载体进行基 因克隆测序 。从基 因组文 库 中克隆相对费时 ，但可获得较多侧翼序列 。另一种则是采用PCR技术 ，即利用基 因两端序列高度保守 的特点 ， 依据保 守区序列设计引物 ，用 PCR 直接扩增基因组 DNA ，然后 用Southem 杂交和非整倍体材料进行定位 ，再亚克隆 后测序。2克隆载体的构 建植物基因转移 的 目的在于将 目的基因导入需要改 良的 植物 ，使之正确而有效地表达 ，并将产生 的 目的性状以可预 言的方式稳定遗传下去 。然而 目的基因片段很难直接转入 植物细胞 ，而且 由于它 自身常无 DNA 复制所需信息 ，在细 胞分裂时不能复制给子细胞 ，从而丢失 ，所以人们要把它连 在一些能独立于细胞染色体之外复制的 DNA 片段上 ，这些DNA片段就叫载体 。常用 的载体有 质粒和病毒 。 质粒是最 常用 的载体 ，它通常是 DNA 环状分子 ， 可以独立地存在 于 细 菌细胞 中 ，
而且 质粒上总是有 1 个或多个可赋予 宿主细 胞以某些有用特性的基 因 ，如质粒上 的抗生素基 因可 以使 作者简介周莎莎（ 1982- ） ，女 ，江 西 南昌人 ，硕士研究生 。研究方 向 ：生物化学与分子 生物 学。收稿 日期2008-10-20280宿主细胞在一定浓度的氯霉素或是氨苄青霉素等抗生素存 在的培养基 中存活 。这些抗生 素基 因在克隆技术中常被用 作选择标记 (selectablemarker)， 以选择和鉴定 重组子 。在基 因克隆 中使用最广泛而且结构最简单的载体一般都来源于 较小 的细 菌质粒 ，如 大肠杆菌 中所存在 的这种质粒载体 ， 不仅 易 于 纯 化 ， 转化效 率高 ， 选 择 重 组 子方便 ， 而 且 可携 带 的外源 目的基 因的容量也较大 （ 大约 5kb ） 。 因此 ，一 些常 规克隆实验都用 质粒载体 。 质粒除 了在细 菌细胞 中广泛存 在 外 ，其他细胞 中并不普遍存在 ，如 在 真核细 胞 中仅 发现 极 少 的几 种 质 粒 ， 其 中研 究最深 的 是 酵 母 ( Saccharomycescerevisiae) 中的 2um 环 (2umcircle) ，人们已经将其构建成了 能在酵母 中表达的载体 ，使基因工程的应用范 围得以扩大 。 为构建高效植物表达载体 ， 人们需要对天然质粒及病 毒进行一 系列改造 ，如加上耐药性基因片段等 ，以提高基因 转化 、筛选 、 表达的效率。构建好载体后 ，将 目的 DNA 片段 与载体实现连接 ，形成全新 的重组 DNA 分子 ，通过一 定 的 方法导入受体植物细胞 ，便可能获得转基因植株 。3报告基 因的选择报告 基 因 (reporter gene) 是 一 种编码可被检测 的 蛋 白 质或酶的基因 ，也就是说 ，是一个其表达产物非常容易被鉴 定 的基 因 。把它的编码序列和基 因表达调节序 列相融合形 成嵌合基因 ，或与其他 目的基因相融合 ，在调控序列控制下 进行表达 ，从而利用 它 的表达产物来标定 目的基 因 的表达 调控 ，筛选得到转化体 。作 为报告基因 ，在遗传选择和 筛选 检测方面必须具有 以下几个条件 ：一 是 已被克隆和全序列 已 测定 ；二是表达产物在受体细胞 中不存在 ，即 无背景 ，在 被转染 的细胞 中无相似 的内源性表达产物 ；三是其表达产 物能进行定量测定 。在植物基因工程研究领域 ， 已 使用 的报告基因有 以
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