洋金花药材HPLC指纹图谱分析

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洋金花药材HPLC指纹图谱分析

（作者:___________单位: ___________邮编: ___________）

【摘要】 目的 采用高效液相色谱法建立洋金花药材的指纹图谱。方法 以Zorbarx C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)为色谱柱,0.07 mol/L磷酸钠溶液(用磷酸调pH 6.0,含17.5 mmol十二烷基硫酸钠)-乙腈(2∶1)为流动相,流速0.8 mL/min,检测波长216 nm。结果 本方法重复性及精密度良好；聚类分析结果显示,南洋金花与北洋金花化学成分有明显差异。结论 本法可有效控制洋金花药材的质量。 【关键词】 洋金花；指纹图谱；氢溴酸东莨菪碱；高效液相色谱法 Key words：Flos Daturae；fingerprint；scopolamine；HPLC 2005年版《中华人民共和国药典》(一部)收载洋金花为茄科植物白花曼陀罗Datura metel L.的干燥花。另外,地方用药还有茄科曼陀罗属(Datura)植物毛曼陀罗D.innoxia的花,前者称为“南洋金花”,后者称为“北洋金花”。洋金花属剧毒药品,具平喘镇咳、镇痛、解痉的功效,用于哮喘咳嗽、脘腹冷痛、风湿痹痛以及外科麻醉等。迄今,洋金花中已被分离鉴定了39种生物碱和13种内酯成分,其中主要有效成分为东莨菪碱和莨菪碱。目前国内多采用滴定法[1]、薄层扫描法[2]、气相色谱法及高效液相色谱法(HPLC)[3-4]对其中某个生物碱

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进行分析,但不能有效控制药材的内在质量。本试验通过考察10批不同来源的洋金花药材(包括南洋金花、北洋金花),建立了指纹图谱,并对不同种的洋金花测定结果进行了聚类分析。 1 仪器与试药

Agilent 1100 Series型高效液相色谱仪；氢溴酸东莨菪碱对照品购自中国药品生物制品检定所(批号0049-9507,供含量测定用)；乙腈为色谱纯；其余试剂均为分析纯。

洋金花药材由江苏省药品检验所刘舞霞主任药师进行鉴定,分别为白花曼陀罗Datura metel L.或毛曼陀罗D.innoxia的干燥花,即南洋金花或北洋金花。详见表1。 2 色谱条件与系统适用性试验

色谱柱：Zorbarx C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)；流动相：0.07 mol/L磷酸钠溶液(用磷酸调pH至6.0,含17.5 mmol/L十二烷基硫酸钠)-乙腈(2∶1)；流速：0.8 mL/min；检测波长：216 nm。理论板数按氢溴酸东茛菪碱峰计算应不低于4 000。色谱图见图1。表1 10批洋金花来源（略） 3 试验方法

3.1 参照物溶液的制备

由于洋金花中东茛菪碱含量高,且与其他成分分离较好,出峰时间适宜(保留时间为24 min左右),故选东茛菪碱为参照物。精密称取氢溴酸东茛菪碱对照品适量,用0.07 mol/L磷酸钠溶液(用磷酸调pH至

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6.0)使溶解,制成每1 mL含0.5 mg的溶液,作为对照品溶液。 3.2 供试品溶液的制备

取药材粉末(过3号筛)约1 g,精密称定,加入2 mol/L盐酸溶液10 mL,超声处理30 min(频率：40 kHZ,功率：250 W,温度：25～30 ℃),放冷, 滤过,滤液用浓氨试液调pH值至14,用氯仿振摇提取4次,每次10 mL,合并氯仿液,置温水浴上蒸干,残渣用0.07 mol/L磷酸钠溶液(用磷酸调pH至6.0)定量转移至5 mL量瓶中,并稀释至刻度,摇匀,即得。

3.3 方法学考察 3.3.1 稳定性试验

取同一供试品溶液,分别在0、2、4、6、10、15、24 h进样测定。结果表明：峰面积比值占总峰面积5%以上的峰,其色谱峰的相对保留时间和峰面积的比值基本一致,溶液24 h内基本稳定。 3.3.2 精密度试验

取同一供试品溶液,连续进样5次,在上述色谱条件下考察各共有峰的相对保留时间及峰面积比值的一致性。结果表明：峰面积比值占总峰面积5%以上的峰,其色谱峰的相对保留时间和峰面积的比值RSD＜3%,符合中药指纹图谱的技术要求。 3.3.3 重复性试验

取同一份药材,按上述供试品溶液制备方法平行制得5份供试品溶液,依法测定。结果表明：峰面积比值占总峰面积5%以上的峰,其

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色谱峰的相对保留时间和峰面积的比值RSD＜3%,符合中药指纹图谱的技术要求。

3.4 10批样品HPLC指纹图谱测定

取10批不同来源的洋金花药材,按上述供试品溶液制备方法制备10份供试品溶液。精密吸取10份供试品溶液和对照品溶液各10 μL,分别注入液相色谱仪,按照上述色谱条件记录60 min的色谱峰。以氢溴酸东茛菪碱峰的保留时间及峰面积为1,计算各共有指纹峰的相对保留时间和峰面积比值。

4 10批洋金花药材化学模式识别研究 4.1 原理

系统聚类法的基本思想是：先将n个样本各自看成一类,然后规定样本之间的距离。开始,因每个样本自成一类,类与类之间的距离是相等的,选择距离最小的两类或多类合并成一个新类,并计算该新类和其他类的距离,再将距离最近的两类合并,这样每次减少一类,直至所有样本都成为一类为止。

类与类之间的距离有许多定义的方法,不同的定义就产生了系统聚类的不同方法。常用的有最短距离法、最长距离法、中间距离法、重心法、类平均法、离差平方和法等。 4.2 方法与结果

将10批洋金花药材指纹图谱数据分别读入程序计算,采用欧氏最近距离及平均距离方法分别进行聚类,范围标度化预处理,结果见图2。

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聚类分析结果表明：来源为武汉、苏州的洋金花(经专家鉴定为北洋金花)所含成分与其他来源的洋金花药材(经专家鉴定为南洋金花)所含成分的聚类距离最远,在欧氏最近距离聚类及欧氏平均距离聚类分析法中来源为武汉、苏州的洋金花(北洋金花)所含成分距离接近并为一类。说明不同种的洋金花药材(南洋金花与北洋金花)成分有较明显的差异,而同种的洋金花药材间成分相对接近。 5 讨论

以硅胶为基质的反相键合填料表面不同程度地残存硅醇基,残存的硅醇基与待分离的碱性物质相互作用而导致峰严重拖尾及分辨率降低。所以,反相HPLC法在生物碱的分析中常需调整流动相的pH值,使用一定离子类型和浓度的缓冲液作为流动相,并利用二次添加剂(主要指离子对试剂)改善分离。本试验采用离子对色谱技术,即在流动相中加入十二烷基硫酸钠作为对离子,在适当pH值下与莨菪烷类生物碱结合形成离子对,从而使性质相似的莨菪烷类生物碱在反相色谱系统中获得适当保留和较好分离。为了达到《中药指纹图谱研究的技术要求(暂行)》中的规定,应选择出峰数目比较多、各共有峰响应尽可能相当者,作为指纹图谱的测定波长,以便表达更多的信息。本试验通过DAD检测,选取216 nm作为检测波长。在此波长处,各峰分离良好,且各峰响应值均较大。