志贺菌分子生物学检测方法研究现状

志贺菌分子生物学检测方法研究现状

作者：庞歌 李娜 周敏 刘艳美

来源：《河南农业·综合版》 2014年第2期

河南农业职业学院 庞 歌 李 娜 周 敏 刘艳美

摘 要：志贺氏菌又称痢疾杆菌，是细菌性痢疾的病原菌。多年来，志贺氏菌引起的鸡腹泻对养鸡经济效益的影响很大，已引起高度重视。着重介绍了志贺氏菌分子生物学检测方法的研究现状，为临床诊断治疗志贺氏菌引起的腹泻病提供可靠依据。

关键词：志贺氏菌；分子生物学检测方法；研究现状

志贺菌属是人类细菌性痢疾最为常见的病原菌，通称痢疾杆菌，是细菌性痢疾的病原菌。临床上能引起痢疾症状的病原生物很多，有志贺氏菌、沙门氏菌、变形杆菌、大肠杆菌等，还有阿米巴原虫、鞭毛虫以及病毒等均可引起人类痢疾，其中以志贺氏菌引起的细菌性痢疾最为常见。

一、志贺氏菌的抗原类型及其致病性

（一）志贺氏菌的抗原类型

志贺菌属有O和K两种抗原。O抗原是分类的依据，分群特异抗原和型特异抗原，藉以将志贺菌属分为4群（种），40余血清型（包括亚型）。K抗原在分类上无意义，但可阻止O抗原与O抗体的结合。A群即痢疾志贺菌。有10个血清型，其中8型尚可分为3个亚型。是惟一不能发酵甘露醇的一群志贺菌。B群即福氏志贺菌。有13个血清型（包括变型和亚型），各型间有交叉反应。C群即鲍氏志贺菌，有18个血清型。D群即宋内志贺菌。抗原单一，只有1个血清型。宋内志贺菌有Ⅰ相和Ⅱ相两个交叉变异相。

（二）志贺氏菌的致病性

志贺菌引起细菌性痢疾。传染源是病人和带菌者，无动物宿主。主要通过粪—口传播。急性患者排菌量大，每克粪便可有105～108个菌体，传染性强；慢性病例排菌时间长，可长期储存病原体；恢复期病人带菌可达2～3周，有的可达数月。人类对志贺菌较易感，少至200个菌就可发病。

志贺菌随饮食进入肠道，潜伏期一般1～3 d。痢疾志贺菌感染患者病情较重，宋内志贺菌多引起轻型感染，福氏志贺菌感染易转变为慢性，病程迁延。

志贺菌感染有急性和慢性两种类型，病程在两个月以上者属慢性。急性细菌性痢疾常有发热、腹痛、里急后重等症状，并脓血粘液便。若及时治疗，预后良好。如治疗不彻底，可转为慢性。症状不典型者，易被误诊，影响治疗而造成慢性和带菌。急性感染中有一种中毒性痢疾，以小儿为多见。无明显的消化道症状，主要表现为全身中毒症状。因其内毒素致使微血管痉挛、缺血和缺氧，导致DIC、多器官功能衰竭、脑水肿，死亡率高。

目前， 对于动物志贺氏菌病的研究国外仅有极少报道， 且缺乏深入研究，但国外医学界在上世纪80年代就已注意到了志贺氏菌携带动物及其流行病学的重要性。关于人志贺氏菌病的研究，国内外医学界已有许多相关报道，并指出人主要表现拉稀和痢疾并以幼龄儿童发病和死亡率较高。由于鸡群的发病特点和流行病学特点与人的情况雷同，因此，对本病开展广泛深入的研究，在兽医和医学公共卫生学方面均具有重要的理论意义和现实意义。

二、志贺氏菌的分子生物学检测方法

准平皿计数是测定病原微生物的标准方法，但其培养、筛选、鉴定操作繁琐、耗时长、且仅能测定活菌的总数，对一些特定的病原菌和污染菌无法有针对性地测定其是否存在及其数量，对已杀菌或灭活的食物更是无能为力。分子生物学方法则可针对病原微生物的核酸分子特征进行鉴定。

（一）核酸分子杂交

是有特异探针（特定标记的已知核酸片段）识别特异碱基序列（基因）实现杂交。它从分子水平上检测病原微生物，不受标本纯度的影响，可直接检测。不需人工检索而直接鉴定出特定的微生物或病原菌，在一张滤膜上进行多个样品的检测，缩短了大量样品检测的时间。根据探针的来源不同，有采用分子克隆或PCR技术从基因文库筛选或扩增方法制备的DNA探针，还有 cDNA探针、RNA探针和寡核苷酸探针，现已应用于各种病原微生物检测和来源、途径的调查。如，Jianch-

Chen 对李斯特菌JBL1231的基因组DNA进行消化、质粒转移和提取等步骤后获得PUC18的3个衍生物片断，经过荧光标记后作为基因探针用于检测样本中李斯特菌的存在。

（二）基因重组法

由于基因重组，尤其是转化作用，仅出现于同种或亲缘关系十分近的菌株之间，所以基因重组技术可以用于细菌的分类和鉴定中。如，用转化法测定由食品传染的、能引起痢疾的志贺氏细菌。基因重组法无需对待测菌株进行纯培养，而且无需什么特殊的试剂和设备，简便易行，所以是一种很有前途的鉴定法。

（三）PCR检测

志贺菌的目的基因，除上述编码各种毒素的核酸片段set1A、set1B、sen外，还包括可用于志贺菌属检测的ipaH、iaL和stx等片段，这些片段均为质粒携带。目前最常使用的扩增模板基因就是编码侵袭性质粒相关抗原H

的片段（ipaH），研究发现，采用ipaH-PCR能检测到志贺菌的最低浓度可以达到2×102 cfu/ml，表明该项技术在具有100%特异性的同时还具有极高的灵敏度，这对腹泻病例筛查十分有利。

2007年胡建华等人建立牛奶中快PCR检测志贺氏菌的有效方法；1995 年王军等人在检测粪便中志贺氏菌和侵袭性大肠杆菌的实验中，使用PCR扩增技术，其敏感性可达≤1个细菌/g；2007年韩华忠等建立了多重PCR快速检测志贺菌和副溶血性弧菌的新方法，在同一反应管内，用两对不同的引物同时检测2种病原菌的存在。PCR技术不仅克服了核酸分子杂交技术的不足，而且为分子流行病学研究提供了特异、敏感、简便、快速的手段。直接从粪便标本中粗提志贺氏菌质粒DNA，经PCR体外扩增，再用侵袭基因探针检测扩增产物，其敏感度为标推杂交技术的102~105倍； Lanpel等直接从污染的食品中提取DNA用PCR进行体外扩增，再以Southern Blot检测，在不到1 d的时间内检出食品中的侵袭性肠道菌。

（四）多位点酶电泳

1970年Manwell和Baker等详细介绍了使用凝胶电泳研究酶的多态性变异的标准实验方法。Selander率先应用多位点酶电泳研究了致病性大肠杆菌和志贺氏菌的群体遗传结构和分类，此

后，Howard等研究了1 600株致病性大肠杆菌和123株志贺氏菌的酶多态性和群体结构，发现所有菌12种酶均呈多态，致病性大肠杆菌与志贺氏菌77%的同工酶是相近的。且该资料较其他方法更进一步证实了致病性大肠杆菌与志贺氏菌间的系统关系。

（五）16s rRNA 序列分析及RAPD技术

病原菌的传统检测鉴定主要是通过培养、生化和免疫学方法，但都存在明显的不足。近10多年来，随着分子生物学理论和技术的迅速发展，产生了许多新的分类方法，其中16s rRNA 序列分析及RAPD技术也已被运用于志贺氏菌的鉴定。它们主要是对细菌染色体进行直接的DNA分析，从遗传进化的角度去认识志贺氏菌，从分子水平进行分类与鉴定， 使细菌的分类越来越科学和精确。李君文等将RAPD技术用于水或食品中志贺氏菌的鉴定，从而成功地建立了水或食品中志贺氏菌的快速鉴定方法。

志贺氏菌的质粒图谱、限制性酶切图谱操作简便、快速；核酸分子杂交及PCR具有特异、快速、敏感的特点；多位点酶电泳可估计等位基因的变异，提供菌群间的遗传联系，它们从分子或基因角度揭示了志贺氏菌病的分布及影响分布的因素，不仅是疾病监测的有效手段，而且为菌痢防治措施的制定，防制效果的评价提供了可靠的依据。随着分子流行病学的不断发展和完善，它们将在志贺氏菌病研究中发挥更大的作用。

三、志贺氏菌的公共卫生学意义

细菌性痢疾又称志贺氏菌病，由志贺氏菌属引起，是发展中国家的常见病、多发病，严重危害着人们的健康，尤其是儿童的生长发育。全世界每年死于志贺氏菌感染的人数为60万。据1994—1997年的监测资料表明，我国年报告病例在60～85万，发病率居甲乙类传染病之首，病死率0.04%～

0.07%。志贺氏菌致病性强，10~100个细菌细胞就可使人发病，多数临床分离的菌株为多重耐药性。动物方面，志贺氏菌可感染猴、鸡、家兔、犊牛、幼犬、狐狸仔猪、小鼠、豚鼠等多种动物。蒋建军等（2006）报道，2001年石河子某规模化兔场痢疾志贺氏菌病的发病率高达40% ，病死率达80%。

许兰菊等（2004）报道国内首次发现鸡志贺氏菌病，该病主要以雏鸡脓血痢和肠道出血病变为主要特征，发病率100%，死亡率达3.84%～33.3%，耐过鸡生长缓慢；高凤山等（2007）报道，2001年9月，黑龙江某地区一养殖户发生新生幼犬志贺氏菌病，同窝幼犬死亡率达60% ，且耐过者发育不良。该病不但严重危害了人和动物的健康和生命安全，还给畜牧养殖业造成了严重的经济损失。因此，对志贺氏菌病的研究不但在兽医方面，而且在医学公共卫生方面具有重要的意义。

综上所述，对腹泻重要病原菌志贺氏菌分子生物学检测方法研究现状的了解，可以为诊断和防止腹泻的发生提供可靠的理论依据和条件，减少腹泻的发病率和死亡率，降低因盲目用药而造成的经费开支，保护环境，减少肉蛋的污染，降低人腹泻传染的可能性，使消费者能够吃上安全放心的绿色肉蛋食品。

参考文献：

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