微生物的颜色法鉴定
Jvo Siegrist
微生物学焦点 1.4 版
颜色是我们生活中用于区分的一种重要工具。 生化试验通常使用显色系统。
默克带你走进微生物的实验室，对于微生物学家而言，最基础的染色方法是由丹麦细菌学家Hans Christian Gram在1884年开发的。革兰氏染色可确定细菌的形态，并将其分为两大类。染成紫色的细菌被称为“革兰氏阳性”。染成粉色的则被称为“革兰氏阴性”。这种染色技术可提供有关细胞壁结构的信息，因为革兰氏阳性菌只含有一种肽聚糖网格，而革兰氏阴性菌则还具有额外的脂质双层。该信息对预测抗生素反应很重要，因为很多抗生素只对革兰氏阳性菌起效。革兰氏染色对于细菌鉴定仍然重要，是生化试验的选择基础。（表1和图1）。
图 1.革兰氏染色（左边是革兰氏阳性蜡样芽孢杆菌，右边是革兰氏阴性柠檬酸杆菌）。
货号
产品描述
77730革兰氏染色试剂盒for microscopy
货号 产品描述
94448革兰氏结晶紫 溶液for microscopy
革兰氏碘 溶液for microscopy
革兰氏脱色液 溶液
革兰氏藏红 溶液for microscopy
90107
7548294635
水或食品质控中确定或测定细菌通常需要快速、简便、低成本的方法。可满足要求的方法一种是用显色和荧光底物与选择性培养基结合。另一种是使用生化检测试剂。所有生化试验都基于对不同微生物特征酶活性的选择性检测。检测目的是辨别病原体、挑出具体问题和指示特定水平存在的目标生物。多数情况下鉴定流程图（图2）可以帮助展示简单方法。这样的ID流程图里当然有其他不使用颜色法的试验，比如过氧化氢酶试验（生成气泡）、生长或抑制试验、显微镜试验等。
最出名和最常用的试验之一是利用有色络合物的吲哚试验（Kovac试剂）。通过色氨酸酶从色氨酸分子中分离吲哚（苯并吡咯）的能力被用来鉴定肠杆菌科。色氨酸酶将色氨酸分解为吲哚、丙酮酸和NH3。试剂中的p-氨基苯甲醛与吲哚结合形成溶于酒精、乙醚和氯仿的樱桃红络合物。
图 2.革兰氏染色（左边是革兰氏阳性蜡样芽孢杆菌，右边是革兰氏阴性柠檬酸杆菌）。
图 3.革兰氏染色（左边是革兰氏阳性蜡样芽孢杆菌，右边是革兰氏阴性柠檬酸杆菌）。
而试剂中的异戊醇或丁醇使其处于上层液相，阳性反应中会显樱桃红色。建议使用不含葡萄糖的生长培养基和高色氨酸含量的蛋白胨。Kovac试剂被加入到24-48小时的旧培养物中，比如在胰蛋白胨水中孵育的（70194）。如接种更多少量体积的细胞材料，孵育时间可以减少到4小时。轻微摇晃加速萃取，阳性反应会在不到一分钟内显樱桃红色。阴性反应没有颜色变化。
另一常用方法是用指示剂检测酶反应。最常用指示剂是pH指示剂，也有其他的比如氧化还原指示剂。最简单方法是检测某类糖发酵，比如右旋糖、乳糖或其他糖类。利用这种方法的有许多培养基，比如带溴甲酚紫指示剂的叠氮化物葡萄糖肉汤（图4）与酚红肉汤, 检测原理是发酵生成的酸会在pH指示剂下变色。
图 4.革兰氏染色（左边是革兰氏阳性蜡样芽孢杆菌，右边是革兰氏阴性柠檬酸杆菌）。
其他方法生成硫化氢比如柠檬酸铁铵（培养基）或乙酸铅（检测条）。一个有趣的方法是β-内酰胺酶检测试剂盒，用于微生物β-内酰胺酶活性的快速酸量滴定法检测。它的原理是苄青霉素中β-内酰胺环的水解，从而导致青霉噻唑酸的生成。该过程会使细菌悬浮液酸化，并改变酸度指示剂的颜色。含β-内酰胺酶的微生物溶液颜色会由红转黄。10-30分钟后可读取结果（图5）。
利用颜色反应区分鉴定的产品有很多，所有这类Sigma-Aldrich产品见下面的产品组： 鉴定试验和试剂 i. 生化试剂
ii.生化测试片和测试条 iii.试验试剂盒 培养基
I.生化鉴定培养基 ii.显色培养基 iii.荧光培养基
图 5.?-内酰胺酶检测试剂盒（阳性反应体现为颜色变黄）
检测目标 货号 测试 乙酸酯酶 04739 吲哚酚测试条
乙偶姻生成
29333 39442 07689
Barritt试剂A
Barritt试剂B O'Meara试剂
酸生成 08714 甲基红溶液
氨基肽酶 75554 氨基肽酶试纸
过氧化氢酶 88597 过氧化氢酶试验
凝固酶
75832 74226
凝固酶试验（玻片法） 凝固酶试验（试管法）
七叶苷水解 80507 胆汁七叶苷片
?-半乳糖苷通透酶,?-半乳糖苷酶
49940
ONPG片
马尿酸盐水解
40405 01869
马尿酸盐片 马尿酸盐测试条盒
内酰胺酶
80489 40561 49862
Β-内酰胺酶测试试剂盒 β-内酰胺酶检测试剂盒 头孢硝噻吩片
脂肪酶 来源于猪胰腺
75744
三丁酸甘油酯测试条
硝酸盐还原酶
07773 38497 39441 08086 51138 73426
细菌尿检测试剂盒 硝酸盐试剂A 硝酸盐试剂B 硝酸盐试剂片 硝酸盐试剂片盒 硝酸盐还原试验
乙酸酯酶
07345 07817 18502 40560 70439
按照Gaby-Hadley方法的氧化酶试剂A 按照Gaby-Hadley方法的氧化酶试剂B 按照Gordon-McLeod方法的氧化酶试剂 氧化酶测试条 氧化酶试片
吡咯烷酮肽酶 67886 吡咯烷酮肽酶测试条
血晶素需求
08482 77148
X+V因子纸片 X因子纸片
NAD需求
89788 08482
V因子纸片 X+V因子纸片
杆菌肽敏感 08382 杆菌肽片
奥普托欣敏感 74042 奥普托欣片
硫酸盐还原作用
06728 硫化氢测试条
色氨酸脱氨酶 80353 TDA试剂
05686 49825 67309 60983 78719
DMACA吲哚片 DMACA试剂 Kovac吲哚试剂 Kovac吲哚试剂 Kovac试剂测试条
色氨酸酶
表 2生化试验
材料
货号
产品描述
75554083822933339442805077583205686氨基肽酶试纸suitable for microbiology 杆菌肽片suitable for microbiology Barritt 试剂 Asuitable for microbiology Barritt 试剂 Bsuitable for microbiology 胆汁七叶苷片suitable for microbiology 凝固酶试验（玻片法）suitable for microbiology DMACA 吲哚片suitable for microbiology
498254944487548290107946357773040405018698859704739609836730978719 硒氰酸苯酯96%
革兰氏结晶紫 溶液for microscopy 革兰氏脱色液 溶液
革兰氏碘 溶液for microscopy 革兰氏藏红 溶液for microscopy 革兰氏染色试剂盒for microscopy 马尿酸盐片suitable for microbiology
马尿酸盐测试试剂盒suitable for microbiology 过氧化氢 溶液3%, suitable for microbiology 吲哚酚测试条suitable for microbiology Kovac 吲哚试剂suitable for microbiology Kovac 吲哚试剂suitable for microbiology Kovac′s Reagent Stripssuitable for microbiology
微生物颜色测定方法
