第 21章 常用分子生物学技术的原理及其应用 学习要求
1.掌握分子杂交、印迹技术、 PCR 技术、核酸序列分析技术、基因文库构建的基本原理及 应用;基因诊断、基因治疗的基本概念。
2.熟悉生物大分子相互作用的研究技术;基因诊断的方法;基因治疗的策略和程序。
3.了解生物芯片技术、遗传修饰动物模型的建立及应用、疾病相关基因的克隆与鉴定。 基本知识点
本章简要介绍了目前医学分子生物学中的部分常用技术。 主要内容包括:分子杂交技术、 印 迹技术、 PCR 技术、核酸序列分析技术、基因文库构建的基本原理及应用、生物芯片技术、生 物大分子相互作用研究技术、 遗传修饰动物模型的建立及应用、 疾病相关基因的克隆与鉴定以及 基因诊断和基因治疗技术。
印迹技术是指将在凝胶中分离的生物大分子转移或直接放在固定化介质上并加以检测分析 的技术。它主要包括 DNA 印迹技术、 RNA 印迹技术和蛋白质印迹技术。 DNA 印迹技术主要用 于基因组 DNA 的定性和定量分析。 RNA 印迹技术主要用于检测某一组织中或细胞中已知的特异 mRNA 的表达水平,也可比较基因的表达情况。蛋白质印迹技术用于检测样品中特异性的蛋白 质的存在、 细胞中特异蛋白质的半定量分析以及蛋白质分子的相互作用研究等。 其它方法还有斑 点印迹、原位杂交、 DNA 芯片技术等。
PCR 技术以拟扩增的 DNA 分子为模板, 以一对与模板互补的寡核苷酸片段为引物, 在 DNA 聚合酶作用下, 依半保留复制机制沿模板链延伸直至完成两条新链的合成。 重复这一过程, 即可 使目的 DNA 片段得到扩增。 PCR 反应体系的基本成分包括:①模板;② DNA ;③特异引物;④ 耐热 DNA 聚合酶; ⑤ dNTP ; ⑥含 Mg 2+的缓冲液。 PCR 的基本反应步骤包括变性、 退火和延伸。 该技术具有高敏感、高特异、可重复以及快速简便等优点。 PCR 技术主要用于:①目的基因的 克隆; ②基因
的体外突变; ③ DNA 和 RNA 的微量分析; ④ DNA 序列测定; ⑤基因突变分析等。 核酸序列分析技术有手工测序和自动测序, 其原理主要建立在化学裂解法或 DNA 链末端合 成终止法的基础上。目前广泛应用的是 DNA 自动测序。
基因文库是指一个包含了某一生物体全部 DNA 序列的克隆群体。其可分为基因组 DNA 文 库和 cDNA 文库。
生物芯片包括基因芯片和蛋白质芯片。生物芯片技术是一项新的规模化生物信息分析技术。 该技术主要应用包括基因表达检测、 基因突变检测、 基因诊断、 功能基因组研究、 基因组作图和
新基因发现等多个方面。
生物大分子之间形成的各种复合物, 在生命活动中起着重要作用。 研究各种生物大分子相互 作用方式的相关技术, 也变得日益重要。 酵母双杂交和标签蛋白沉淀是目前分析蛋白质相互作用 的主要手段。 电泳迁移率变动测定和染色质免疫沉淀法是研究 DNA-蛋白质相互作用的重要分析 技术。
转基因动物、 动物整体克隆技术、 基因剔除技术在建立疾病的动物模型、 探讨疾病的发生机 制方面具有重要价值。
从基因水平研究疾病的发病机制, 采取针对性措施治疗患者, 是医学日后发展方向。 基因诊 断和基因治疗已成为现代医学的重要内容。
一、选择题 (一 A 型题
1.分子杂交实验不能用于
A .单链 DNA 与 RNA 分子之间的杂交 B .双链 DNA 与 RNA 分子之间的杂交 C .单链 RNA 分子之间的杂交 D .单链 DNA 分子之间的杂交
E .抗原与抗体分子之间的杂交 2.关于探针叙述错误的是
A .带有特殊标记 B .具有特定序列 C .必须是双链的核酸片段 D .可以是基因组 DNA 片段 E .可以是抗体 3.下列哪种物质不能用作探针
A . DNA 片段 B . cDNA C .蛋白质 D .氨基酸 E . RNA 片段 4.印迹技术可以分为
A . DNA 印迹 B . RNA 印迹 C .蛋白质印迹 D .斑点印迹 E .以上都对
5. PCR 实验延伸温度一般是
A . 90℃ B . 72℃ C . 80℃ D . 95℃ E . 60℃ 6. Western blot 中的探针是
A . RNA B .单链 DNA C . cDNA D .抗体 E .双链 DNA 7. Northern blotting与 Southern blotting不同的是
A .基本原理不同 B .无需进行限制性内切酶消化 C .探针必须是 RNA D .探针必须是 DNA E .靠毛细作用进行转移
8.可以不经电泳分离而直接点样在 NC 膜上进行杂交分析的是 A .斑点印迹 B .原位杂交 C . RNA 印迹 D . DNA 芯片技术 E . DNA 印迹
9.下列哪种物质在 PCR 反应中不能作为模板
A . RNA B .单链 DNA C . cDNA D .蛋白质 E .双链 DNA 10. RT-PCR 中不涉及的是
A .探针 B . cDNA C .逆转录酶 D . RNA E . dNTP 11.关于 PCR 的基本成分叙述错误的是 A .特异性引物 B .耐热性 DNA 聚合酶 C . dNTP D .含有 Zn 2+的缓冲液 E .模板 12. DNA 链末端合成终止法不需要
A . ddNTP B . dNTP C .引物标记 D . DNA 聚合酶 E .模板 13. cDNA 文库构建不需要
A .提取 mRNA B .限制性内切酶裂解 mRNA C .逆转录合成 cDNA D .将 cDNA 克隆入质粒或噬菌体 E .重组载体转化宿主细胞 14.标签蛋白沉淀是
A .研究蛋白质相互作用的技术 B .基于亲和色谱原理 C .常用标签是 GST D .也可以是 6组氨酸标签 E .以上都对 15.研究蛋白质与 DNA 在染色质环境下相互作用的技术是 A .标签蛋白沉淀 B .酵母双杂交 C .凝胶迁移变动实验 D .染色质免疫沉淀法 E .噬菌体显示筛选系统 16.动物整体克隆技术又称为
A .转基因技术 B .基因灭活技术 C .核转移技术 D .基因剔除技术 E .基因转移技术
17.目前主要克隆的致病基因是
A .糖尿病致病基因 B .恶性肿瘤致病基因 C .单基因致病基因 D .多基因致病基因 E .高血压致病基因 18.基因疫苗主要是指
A . DNA 疫苗 B . RNA 疫苗 C .反义核酸 D .核酶 E .小干扰 RNA 19.目前基因治疗中选用最多的基因载体是
A .非病毒载体 B .脂质体 C .病毒载体 D .噬菌体 E .质粒 20.目前基因治疗多采用的方法是
A .基因增补 B .基因置换 C .基因矫正 D .基因灭活 E .基因疫苗 (二 B 型题 A . Southern blotting B . Northern blotting C . Western blotting D . dot blotting E . in situ hybridization
1.不需要电泳、转膜等程序,直接将样品点在 NC 膜上用于杂交分析。 2.电泳前不需进行限制性内切酶消化,可以用于检测细胞中已知的特异 mRNA 水平。
第21章 常用分子生物学技术的原理及其应用.
