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本技术提供一种弧菌属菌种的鉴定方法，其中所使用的弧菌属菌种的可视化的鉴定区间标准，其建立方法如下：利用高效液相质谱联用仪采集不同菌种的LCMS代谢产物谱，将所得代谢物信息建立分析数据矩阵，用SIMCAP进行PCA分析，获得直观的聚类图和载荷图，利用OPLSDA模式分析，得到不同菌种的分布区间，建立不同菌株的可视化的鉴定区间。本技术的方法以细菌代谢组学为基础，对细菌的代谢物进行分析，通过数据判别，得出了不同菌种的生物标志物，以此为参数，建立不同菌种的分布规律，从而建立了一种新的菌种鉴定方法，弥补现有方法的不准确性，具有高通量、高灵敏度、准确性高等特点。
技术要求
1.一种鉴定弧菌属菌种的可视化的鉴定区间标准，其特征在于，所述的标准的建立方法如下：利用高效液相质谱联用仪采集不同菌种的LC-MS代
谢产物谱，将所得代谢物信息建立分析数据矩阵，用SIMCA-P进行PCA分析，获得直观的聚类图和载荷图，利用OPLS-DA模式分析，得到不同菌种的分布区间，建立不同菌株的可视化的鉴定区间。
2.如权利要求1所述的鉴定区间标准，其特征在于，所述的代谢产物包含有1-磷酸岩藻糖，D-乳酸，dTMP，黄素单核苷酸，环磷酸肌醇，UDP-N-乙酰壁氨酰-L-丙氨酸，胞磷胆碱，UDP-L-鼠李糖，甘露聚糖，UDP-葡萄糖，叶酸，花生四烯酸，二磷酸肌苷，UDP-D-木糖，磷酸乙醛，γ-谷氨酰半胱氨酸，半乳糖酸，甘油酸，D-葡萄糖-1,5-内酯6-磷酸，5-羟基异尿酸盐，苯甲酰磷酸酯，L-色氨酸，5-磷酸氧基-L-赖氨酸，马来乙酸，乙醛酸，N-乙酰血清素，犬尿胺，乌头酸，脱氧胞苷，尿囊素，棕榈酸，1,7-二甲基鸟苷，乙醇酸，D-柠檬烯，2-羟基十四烷酸，脱氧肌苷，5α-胆甾烷醇，棕榈醛，鞘氨醇，3-甲基硫代丙酸，二十碳五烯酸，精胺，十四烷二酸，酵母氨酸，硬脂酸，5-戊二胺，十五酸，鞘胺醇，棕榈酰胺，亚油酸，球形烯醇，十八烷二酸，十九烷酸，花生酸，结核硬脂酸，维生素D3，半乳糖基鞘氨醇，D-乳酸，乳清苷，丁香酸，胞苷一磷酸，6-磷酸葡萄糖，鸟苷一磷酸，苯乙酰甘氨酸，胞壁酸，黄嘌呤，L-赖氨酸，羟基赖氨酸，3-甲氧酪胺，5-甲基胞嘧啶，α-D-葡萄糖，鸟氨酸，犬尿喹啉酸，山梨醇，β-丙氨酸，D-核糖，6-羟基烟酸，甘油和酪胺。
3.一种鉴定弧菌属菌株的方法，其特征在于，所述的方法，是使用权利要求1或2所述的鉴定区间标准来鉴定弧菌属菌株的种类。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的鉴定弧菌属菌株的方法，当测试菌株处于OPLS-DA得分图中的不同区间时，则说明测试菌株亲
缘关系与该区间菌株更近，从而鉴定菌株。
5.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的方法包括如下的步骤2)提取细菌代谢物
将进行扩大培养的待测菌进行破碎后收集上清，制成细菌代谢物；
3)细菌代谢物的分析
使用HPLC-MS方法检测细菌代谢物，色谱条件如下：
LC-30A系统，色谱柱：Inertsil HILIC C18反相色谱柱150mm×3.0mm，3μm，岛津，日本)；柱温为30℃；进样体积为1.0μL；流动相A为0.1％(v/v)甲
酸水溶液，流动相B为0.1％(v/v)甲酸乙腈溶液；梯度洗脱程序：0-5.0min，5％，5.0-10.0min，10％，10.0-15.0min，20％，15.0-20.0min，40％；流速为0.3mL/min；
质谱条件：ESI源，采用正离子模式；离子源接口电压:4.0kV；气体流速10.0L/min；干燥气体流速10.0L/min，加热气体流速10.0L/min；加热模块温度:400℃；接口温度:300℃；扫描模式:全扫描模式(m/z 50-2000)；
4)将代谢物信息建立分析数据矩阵，用SIMCA-P进行PCA分析，获得直观的聚类图和载荷图，利用OPLS-DA模式分析，得到不同菌种的分布区
间，已上述的可视化的鉴定区间进行比较，确定其种类。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的进行扩大培养，是将待检测的细菌接种于2216E液体培养基中进行扩大培养。
技术说明书
一种弧菌属菌种的鉴定方法技术领域
本技术属于微生物鉴定技术领域，具体涉及一种弧菌属菌种的鉴定方法。背景技术
水产养殖业的迅速发展使水产养殖规模不断扩大，养殖产量持续增长。但是，随着养殖集约化程度不断提高，水产动物生活环境中的应激条件日益增多，病动物病害已经成为我国水产养殖业能否稳定、持续发展的瓶颈。
水产动物病害主要是细菌性病害，有效防治依赖于对菌种快速、准确的鉴定，为了进一步适应菌种鉴定和防治的需求，研究快速、准确的菌种鉴定方法就显
传统的菌种鉴定方法主要是经验观察法和生化鉴定法，传统方法的准确性和鉴定速度有待提高。近年来，随着免疫学、分子生物学和微电子技术的飞速发展
养水平向分子水平迈进，如酶联免疫吸附法、免疫磁珠技术等免疫学方法，PCR、荧光定量PCR、基因探针技术等方法。这些鉴定方法在灵敏性、鉴定速度等高，但也存在着一些缺陷，如目前这些方法在菌种鉴定的准确性和精确性上还有待提高。技术内容
本技术的目的在于提供一种弧菌属菌种的鉴定方法，从而弥补现有技术的不足。
本技术首先提供一种鉴定弧菌属菌种的可视化的鉴定区间标准，所述的标准的建立方法如下：利用高效液相质谱联用仪采集不同菌种的LC-MS代谢产物谱，
分析数据矩阵，用SIMCA-P进行PCA分析，获得直观的聚类图和载荷图，利用OPLS-DA模式分析，得到不同菌种的分布区间，建立不同菌株的可视化的鉴定
所述的代谢产物，包含有1-磷酸岩藻糖，D-乳酸，dTMP，黄素单核苷酸，环磷酸肌醇，UDP-N-乙酰壁氨酰-L-丙氨酸，胞磷胆碱，UDP-L-鼠李糖，甘露聚糖
花生四烯酸，二磷酸肌苷，UDP-D-木糖，磷酸乙醛，γ-谷氨酰半胱氨酸，半乳糖酸，甘油酸，D-葡萄糖-1,5-内酯6-磷酸，5-羟基异尿酸盐，苯甲酰磷酸酯，L
赖氨酸，马来乙酸，乙醛酸，N-乙酰血清素，犬尿胺，乌头酸，脱氧胞苷，尿囊素，棕榈酸，1,7-二甲基鸟苷，乙醇酸，D-柠檬烯，2-羟基十四烷酸，脱氧肌
榈醛，鞘氨醇，3-甲基硫代丙酸，二十碳五烯酸，精胺，十四烷二酸，酵母氨酸，硬脂酸，5-戊二胺，十五酸，鞘胺醇，棕榈酰胺，亚油酸，球形烯醇，十八
生酸，结核硬脂酸，维生素D3，半乳糖基鞘氨醇，D-乳酸，乳清苷，丁香酸，胞苷一磷酸，6-磷酸葡萄糖，鸟苷一磷酸，苯乙酰甘氨酸，胞壁酸，黄嘌呤，酸，3-甲氧酪胺，5-甲基胞嘧啶，α-D-葡萄糖，鸟氨酸，犬尿喹啉酸，山梨醇，β-丙氨酸，D-核糖，6-羟基烟酸，甘油和酪胺。
本技术还提供一种鉴定弧菌属菌株的方法，是通过上述的可视化的鉴定区间标准来鉴定菌种；当测试菌株处于OPLS-DA得分图中的不同区间时，则说明测试菌株更近，从而达到鉴定菌株的目的。
所述的鉴定弧菌属菌株的方法，包括如下的步骤：
1)细菌培养
将待检测的细菌分别接种于2216E液体培养基(蛋白胨5g、酵母粉1g、FePO4 0.1g、NaCl 30g、蒸馏水1L)中，传代培养3次，28℃过夜培养。
2)提取细菌代谢物
将进行扩大培养的待测菌进行破碎后收集上清，制成细菌代谢物；
3)细菌代谢物的分析
使用HPLC-MS方法检测细菌代谢物，色谱条件如下：
LC-30A系统，色谱柱：Inertsil HILIC C18反相色谱柱150mm×3.0mm，3μm，岛津，日本)；柱温为30℃；进样体积为1.0μL；流动相A为0.1％(v/v)甲酸水溶液，
酸乙腈溶液；梯度洗脱程序：0-5.0min，5％，5.0-10.0min，10％，10.0-15.0min，20％，15.0-20.0min，40％；流速为0.3mL/min；
质谱条件：ESI源，采用正离子模式；离子源接口电压:4.0kV；气体流速10.0L/min；干燥气体流速10.0L/min，加热气体流速10.0L/min；加热模块温度:400℃；模式:全扫描模式(m/z 50-2000)；
4)将代谢物信息建立分析数据矩阵，用SIMCA-P进行PCA分析，获得直观的聚类图和载荷图，利用OPLS-DA模式分析，得到不同菌种的分布区间，已上述的
比较，确定其种类。
本技术建立了一种新的菌种鉴定方法，该方法以细菌代谢组学为基础，对细菌的代谢物进行分析，通过数据判别，得出了不同菌种的生物标志物，以此为参布规律，从而建立了一种新的菌种鉴定方法，弥补现有方法的不准确性，具有高通量、高灵敏度、准确性高等特点。附图说明
图1：不同菌种的PCA得分散点图；
图2：菌1,2,3和菌4,5,6分组的OPLS-DA得分散点图(A)和VIP柱状图(B)；图3：菌1,2,3和菌7,8,9分组的OPLS-DA得分散点图(A)和VIP柱状图(B)；图4：菌4,5,6和菌7,8,9分组的OPLS-DA得分散点图(A)和VIP柱状图(B)；图5：三组数据中VIP>1代谢物的韦恩图分析图；图6：不同菌种的PCA(A)和OPLS-DA(B)得分散点图；图7：未知菌种的预测结果图。具体实施方式
下面结合实施例和附图对本技术进行详细的描述。实施例1：建立弧菌属菌株的可视化的鉴定区间标准本技术提供一种鉴定菌株的方法，该方法包括如下的步骤：
1)细菌培养
1,2,3是鳗弧菌，4,5,6是副溶血弧菌，7,8,9是溶藻胶弧菌。将上述菌株分别接种于2216E液体培养基(蛋白胨5g、酵母粉1g、FePO4 0.1g、NaCl 30g、蒸馏水1L)中
过夜培养。
2)细菌代谢物的提取
吸取10ml菌液，10000rpm离心，倒掉培养液，PBS洗涤3次，加入1ml 50％的甲醇水溶液混悬，超声波破碎15min，10000rpm离心，收集上清，即为细菌用。
3)细菌代谢物的分析
色谱条件：LC-30A系统，色谱柱：Inertsil HILIC C18反相色谱柱150mm×3.0mm，3μm，岛津，日本)；柱温为30℃；进样体积为1.0μL；流动相A为0.1％(v/v)甲
0.1％(v/v)甲酸乙腈溶液；梯度洗脱程序：0-5.0min，5％，5.0-10.0min，10％，10.0-15.0min，20％，15.0-20.0min，40％；流速为0.3mL/min。
质谱条件：ESI源，采用正离子模式；离子源接口电压:4.0kV；气体流速10.0L/min；干燥气体流速10.0L/min，加热气体流速10.0L/min；加热模块温度:400℃；模式:全扫描模式(m/z 50-2000)。
利用上述的HPLC-MS分析方法，通过对菌种代谢物进行分析，获取菌种代谢物多维信息。通过前期数据分析，正离子模式下，不同菌种得到的代谢物总数为定，鉴定出147个已知代谢物，其他代谢物有待进一步鉴定。
4)菌种标志物的发现
将细菌代谢组学数据导入SIMCA(version 14.0)。首先采用主成分分析方法(Principal Component Analysis，PCA)对数据进行分析，应用PCA观察不同细菌数据的内在变异。图1为对照组与模型组的PCA分析得分散点图。从图中可以看出，三组菌种具有显著地分组趋势。
应用OPLS-DA模式识别方法进一步分析不同菌种的差异。图2(A)为菌1,2,3和菌4,5,6分组得分散点图(score scatter plot)，菌1,2,3和菌4,5,6分组良好；图2(B)为菌
重要性投影(variable important for the projection，VIP)柱状图，变量VIP值越大，表明其组间分类的贡献越大，通常以VIP>1为标准定义重要变量，由图2导出数
(VIP>1代谢物)264个。
图3(A)为菌1,2,3和菌7,8,9分组的得分散点图(score scatter plot)，菌1,2,3和菌7,8,9分组良好；图3(B)为菌1,2,3和菌7,8,9分组的VIP柱状图，由图3导出数据，得到物)254个。
图4(A)为菌4,5,6和菌7,8,9分组的得分散点图(score scatter plot)，菌4,5,6和菌7,8,9分组良好；图4(B)为菌4,5,6和菌7,8,9分组的VIP柱状图，由图4导出数据，得到物)217个。
对三组数据中VIP>1的数据通过韦恩图进行分析，如图5所示，三组数据共有生物标志物为(VIP>1代谢物)79个，因此，可以初步确定这79个生物标志物可以作物。
5)菌种鉴定方法的建立和应用
以79个生物标志物作为参数，建立细菌鉴定的方法，如图5A所示，通过PCA比对，发现三组细菌均具有分组趋势。通过OPLS-DA分析，三组具有明显的分组
的细菌呈聚集状态。通过多数据已知样本的比较，得到同一组细菌的分布区间，当未知细菌通过分析进入OPLS-DA图中，可以根据未知细菌坐落的区间进行
上述已鉴定出的标志物包括，为1-磷酸岩藻糖，D-乳酸，dTMP，黄素单核苷酸，环磷酸肌醇，UDP-N-乙酰壁氨酰-L-丙氨酸，胞磷胆碱，UDP-L-鼠李糖，甘
叶酸，花生四烯酸，二磷酸肌苷，UDP-D-木糖，磷酸乙醛，γ-谷氨酰半胱氨酸，半乳糖酸，甘油酸，D-葡萄糖-1,5-内酯6-磷酸，5-羟基异尿酸盐，苯甲酰磷酸
氧基-L-赖氨酸，马来乙酸，乙醛酸，N-乙酰血清素，犬尿胺，乌头酸，脱氧胞苷，尿囊素，棕榈酸，1,7-二甲基鸟苷，乙醇酸，D-柠檬烯，2-羟基十四烷酸，
醇，棕榈醛，鞘氨醇，3-甲基硫代丙酸，二十碳五烯酸，精胺，十四烷二酸，酵母氨酸，硬脂酸，5-戊二胺，十五酸，鞘胺醇，棕榈酰胺，亚油酸，球形烯醇
酸，花生酸，结核硬脂酸，维生素D3，半乳糖基鞘氨醇，D-乳酸，乳清苷，丁香酸，胞苷一磷酸，6-磷酸葡萄糖，鸟苷一磷酸，苯乙酰甘氨酸，胞壁酸，黄赖氨酸，3-甲氧酪胺，5-甲基胞嘧啶，α-D-葡萄糖，鸟氨酸，犬尿喹啉酸，山梨醇，β-丙氨酸，D-核糖，6-羟基烟酸，甘油，酪胺。表1代谢物信息表
弧菌属菌种的鉴定方法与制作流程
