免疫组化操作步骤之欧阳历创编

由天下分享时间：2024/12/19 10:30:01 加入收藏我要投稿点赞

欧阳历创编 2024..02.09

免疫组化操作步骤

时间：2024.02.09 第一节免疫组化操作步骤及抗原修复（供参考）第二节免疫组化抗原热修复的技术要点（供参考）（一）、仪器设备

1. 18cm不锈钢高压锅或电炉或用微波炉. 2. 水浴锅

创作人：欧阳历

（二）、试剂

1. PBS缓冲液（pH7.2―7.4）

2．0.01mol/L柠檬酸钠缓冲液（CB,pH6.0,1000ml） 3. 3%甲醇―H2O2溶液：用30%H2O2和80%甲醇溶液配制

4. 风裱剂：a. 甘油和0.5mmol/L碳酸盐缓冲液（pH9.0–9.5）等量混合 b 油和TBS(PBS)配制 5．TBS/PBS pH9.0–9.5,适用于荧光纤维镜标本;pH7.0-7.4适合光学纤维标本（三）、操作流程

1、脱蜡和水化：脱蜡前应将组织芯片在室温中放置60分钟或60℃恒温箱中烘烤20分钟。 a 组织芯片置于二甲苯中浸泡10分钟,更换二甲苯后在浸泡10分钟 b 无水乙醇中浸泡五分钟 c 95%乙醇中浸泡五分钟 d 75%乙醇中浸泡五分钟

2、抗原修复：用于福尔马林固定的石蜡包埋组织芯片：

欧阳历创编 2024..02.09

抗原修复（免疫组化石蜡切片）

用于福尔马林固定的石蜡包埋组织芯片需要抗原修复

福尔马林固定的组织有可能破坏了原来组织的抗原结构，蛋白多肽发生交联，导致部分抗原表位封闭，结合位点减少，所以需要抗原修复，以暴露原来的抗原表位，达到充分显露抗原，以不出现明显脱片现象为佳。

抗原修复的几种常用方法（供参考）

1. 微波炉加热：在微波炉里加热0.01枸橼酸钠缓冲液（pH6.0）至沸腾后将组织芯片放入，断电，间隔5-10分钟，反复1-2次。根据玻片情况可参考采用微波加热“3-5-3法”3分钟温火沸腾后静止5分钟，再温火沸腾3分钟即可。

适用的抗原：来源于人、大鼠、小鼠的组织标本；来源于其他动物种属的组织标本： 2. 沸热修复：电炉或水浴锅加热0.01M枸橼酸钠缓冲液（pH6.0）至95℃左右，放入组织芯片加热10-15分钟。

3. 高压热修复：在沸水中加入EDTA(pH8.0)或0.01m枸橼酸钠缓冲溶液（pH6.0）.盖上不锈钢锅盖，但不能锁定。将玻片置于金属染色架上，缓慢加压，使玻片在缓冲液中浸泡五分钟，然后将盖子锁定，小阀门将会升起来。10分钟后除去热源，置入凉水中，当小阀门沉下去后打开盖子。此方法适用于较难检测或核抗原的抗原修复。（骨及软骨组织的标本最好选择较温和的微波加热修复） 4. 酶消化方法：

常用0.1%胰蛋白酶和0.4%胃蛋白酶液。胰蛋白酶使用前预热37℃，消化时间约为5-30分钟。适用于被固定遮蔽的抗原：

包括 Collagen.GFAP. Complement.Cytokeratin.c-erB-2.LCA.LN.等

石蜡切片免疫组化染色步骤 1.三步法（以SP试剂盒为例） ●石蜡切片脱蜡至水。

●蒸馏水冲洗，PBS浸泡5分钟，如果采用抗原修复，可在此步后进行。

欧阳历创编 2024..02.09

●3%H2O2室温孵育5~10分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性，PBS冲洗，2分钟×3次。 ●5~10%正常山羊血清封闭，室温孵育10分钟。倾去血清，勿洗，滴加适当比例稀释的一抗或一抗工作液，37℃孵育1~2小时或4℃过夜。 ●PBS冲洗，2分钟×3次。

●滴加适当比例稀释的生物素标记二抗（1%BSA-PBS稀释），37℃孵育10~30分钟；或滴加第二代生物素标记二抗工作液，37℃或室温孵育10~20分钟。 ●PBS冲洗，2分钟×3次。

●滴加适当比例稀释的辣根酶标记链霉卵白素（PBS稀释），37℃孵育10~30分钟；或第二代辣根酶标记链霉卵白素工作液，37℃或室温孵育10~20分钟。 ●PBS冲洗，2分钟×3次。 ●显色剂显色（DAB或AEC）。

●自来水充分冲洗，复染，脱水透明、封片。 ●如果必要，可选用avdin封闭内源性生物素。 2.SABC法（1）脱蜡、水化（2）PBS洗2次各5分钟

（3）用蒸馏水或PBS配制新鲜的3%H2O2，室温封闭5-10分钟，用蒸馏水洗3次（4）抗原修复（5） PBS洗5分钟

（6）滴加正常山羊血清封闭液，室温20分钟，甩去多余液体（7）滴加Ι抗50ul,室温静置1小时或4℃过夜或37℃1小时（8）PBS洗3次各2分钟

（9）滴加生物素化Ⅱ抗，20℃-37℃ 20分钟（10）PBS洗3次各2分钟