6.3. 检验样品确认表
序号 品名 人工牛黄甲硝唑胶囊 人工牛黄甲硝唑胶囊 人工牛黄甲硝唑胶囊 生产厂家 佛山市华普生药业有限公司 批号 规格 甲硝唑0.2g 人工牛黄5mg 是否按GMP要求生产 □是 □否 1 2 佛山市华普生药业有限公司 甲硝唑0.2g 人工牛黄5mg □是 □否 3 佛山市华普生药业有限公司 甲硝唑0.2g 人工牛黄5mg □是 □否 检查人/日期： 复核人/日期： 7.验证项目和验证方法 7.1试验菌株
人工牛黄甲硝唑胶囊需氧菌总数检查、霉菌和酵母菌总数检查方法验证所用的菌株为金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉；控制菌检查方法验证所用的菌株为大肠埃希菌、乙型副伤寒沙门菌。试验菌株的传代次数不得超过5代，并采用适宜的菌种保藏技术进行保存，以保证试验菌株的生物学特性。
7.2 需氧菌总数检查、霉菌和酵母菌总数检查方法验证的菌液制备
分别接种金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至10ml胰酪大豆胨液体培养基中，30～35℃培养18～24小时，取此培养液1ml加0.9％无菌氯化钠溶液9ml，采用10倍递增稀释法，稀释至10～10,制成50～100cfu/ml的菌悬液备用。
接种白色念珠菌的新鲜培养物至10ml沙氏葡萄糖液体培养基中，20～25℃培养2～3天，取此培养液1ml加0.9％无菌氯化钠溶液9ml，采用10倍递增稀释法，稀释至10～10，制成50～100cfu/ml的菌悬液备用。
接种黑曲霉的新鲜培养物至沙氏葡萄糖琼脂斜面上，20～25℃培养5～7天，直到获得丰富的孢子。加入3～5ml含有0.05%聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱，吸至无菌试
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管中，取1ml加含有0.05%聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液9ml，采用10倍递增稀释法，稀释至10-5～10-7，制成50～100cfu/m的孢子悬液备用。
菌液制备后若在室温下放置，应在2 小时内使用；若保存在2～8℃，可在24小时内使用。黑曲霉孢子悬液可保存在2～8℃ ,在验证过的贮存期内使用。
验证时，对各试验菌的回收率逐一进行验证。
7.3. 需氧菌总数检查、霉菌和酵母菌总数检查方法验证--常规倾注平皿法 7.3.1.供试液的制备
取供试品10g，加0.9%无菌氯化钠溶液至100ml，振摇，制成1：10的供试液。 7.3.2.试验组
取1：10的供试液1ml和7.2项下制备的50～100cfu的试验菌，分别注入平皿中，立即倾注
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不超过45℃的胰酪大豆胨琼脂培养基20ml混匀，每株试验菌株平行制备2个平皿。置30～35℃培养箱中培养3天（金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌），或培养5天（白色念珠菌、黑曲霉），点计菌落数。
另取1：10的供试液1ml和7.2项下制备的50～100cfu的白色念珠菌、黑曲霉，分别注入平皿中，立即倾注不超过45℃的沙氏葡萄糖琼脂培养基20ml混匀，每株试验菌株平行制备2个平皿。置20～25℃培养箱中培养5天，点计菌落数。 7.3.3.供试品对照组
取1：10的供试液1ml注入平皿中，立即倾注不超过45℃的胰酪大豆胨琼脂培养基20ml混匀，平行制备2个平皿。置30～35℃培养箱中培养5天，点计菌落数。
另取1：10的供试液1ml注入平皿中，立即倾注不超过45℃的沙氏葡萄糖琼脂培养基培养基20ml混匀，平行制备2个平皿。置20～25℃培养箱中培养5天，点计菌落数。 7.3.4.菌液对照组
取0.9%无菌氯化钠溶液1ml和7.2项下制备的50～100cfu的试验菌，分别注入平皿中，立即倾注不超过45℃的胰酪大豆胨琼脂培养基20ml混匀，每株试验菌株平行制备2个平皿。置30～35℃培养箱中培养3天（金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌），或培养5天（白色念珠菌、黑曲霉），点计菌落数。
另取0.9%无菌氯化钠溶液1ml和7.2项下制备的50～100cfu的白色念珠菌、黑曲霉，分别注入平皿中，立即倾注不超过45℃的沙氏葡萄糖琼脂培养基培养基20ml混匀，每株试验菌株平行制备2个平皿。置20～25℃培养箱中培养5天，点计菌落数。 7.3.5. 常规倾注平皿法方法验证的接受标准
试验组菌落数减去供试品对照组菌落数的值与菌液对照组菌落数的比值(即试验菌的回收率)应在0 .5?2 范围内。
7.3.6. 常规倾注平皿法方法验证的结果
7.3.6.1. 常规倾注平皿法测定需氧菌总数方法验证结果 试验次数1：
人工牛黄甲硝唑胶囊批号: ；胰酪大豆胨琼脂培养基配制批号： 培养箱 型号 编号 ；培养温度： ；培养时长：金黄色葡萄球菌、铜绿假单
胞菌、枯草芽孢杆菌3天，白色念珠菌、黑曲霉5天
菌种试验菌株 代数 1 试验组 2 均值 供试品对照组 1 2 均值 菌液对照组 1 2 均值 试验菌的回收率 金黄色葡萄球菌 铜绿假单胞菌 枯草芽孢杆菌 白色念珠菌 7 / 20
黑曲霉 试验人/日期： 复核人/日期： 试验次数2：
人工牛黄甲硝唑胶囊批号: ；胰酪大豆胨琼脂培养基配制批号： 培养箱 型号 编号 ；培养温度： ；培养时长：金黄色葡萄球菌、铜绿假单
胞菌、枯草芽孢杆菌3天，白色念珠菌、黑曲霉5天
菌种试验菌株 代数 1 试验组 2 均值 供试品对照组 1 2 均值 菌液对照组 1 2 均值 试验菌的回收率 金黄色葡萄球菌 铜绿假单胞菌 枯草芽孢杆菌 白色念珠菌 黑曲霉 试验人/日期： 复核人/日期： 试验次数3：
人工牛黄甲硝唑胶囊批号: ；胰酪大豆胨琼脂培养基配制批号： 培养箱 型号 编号 ；培养温度： ；培养时长：金黄色葡萄球菌、铜绿假单
胞菌、枯草芽孢杆菌3天，白色念珠菌、黑曲霉5天
菌种试验菌株 代数 1 试验组 2 均值 供试品对照组 1 2 均值 菌液对照组 1 2 均值 试验菌的回收率 金黄色葡萄球菌 铜绿假单胞菌 枯草芽孢杆菌 白色念珠菌 黑曲霉 试验人/日期： 复核人/日期： 7.3.6.2. 常规倾注平皿法测定霉菌与酵母菌总数方法验证结果 试验次数1：
人工牛黄甲硝唑胶囊批号: ；沙氏葡萄糖琼脂培养基配制批号： 培养箱 型号 编号 ；培养温度： ；培养时长：5天
菌种试验菌株 代数 1 试验组 2 均值 供试品对照组 1 2 均值 菌液对照组 1 2 均值 试验菌的回收率 8 / 20
白色念珠菌 黑曲霉 试验人/日期： 复核人/日期： 试验次数2：
人工牛黄甲硝唑胶囊批号: ；沙氏葡萄糖琼脂培养基配制批号： 培养箱 型号 编号 ；培养温度： ；培养时长：5天
菌种试验菌株 代数 1 试验组 2 均值 供试品对照组 1 2 均值 菌液对照组 1 2 均值 试验菌的回收率 白色念珠菌 黑曲霉 试验人/日期： 复核人/日期： 试验次数3：
人工牛黄甲硝唑胶囊批号: ；沙氏葡萄糖琼脂培养基配制批号： 培养箱 型号 编号 ；培养温度： ；培养时长：5天
菌种试验菌株 代数 1 试验组 2 均值 供试品对照组 1 2 均值 菌液对照组 1 2 均值 试验菌的回收率 白色念珠菌 黑曲霉 试验人/日期： 复核人/日期： 7.3.7. 常规倾注平皿法测定需氧菌总数、霉菌与酵母菌总数方法验证小结
按照验证方案的要求进行试验，若各试验菌株的回收率在0.5～2范围内，则可确认常规倾注平皿法适用于本品的需氧菌总数、霉菌与酵母菌总数检查。如常规倾注平皿法适用于霉菌与酵母菌总数检查，但不适用于需氧菌总数检查，则下面进一步验证可去除供试品抑菌物质的离心沉淀-薄膜过滤法是否适用于本品的需氧菌总数检查。
7.4. 需氧菌总数检查—离心沉淀-薄膜过滤法 7.4.1.供试液的制备
取供试品10g，加0.9%无菌氯化钠溶液至100ml，振摇，制成1：10的供试液贮备液。取1:10的供试液贮备液50ml，经500转/分钟离心3分钟，取上清液得供试液。 7.4.2.试验组
取供试液1 ml，加至100 ml 0.9%无菌氯化钠溶液中，混匀，全量通过薄膜（孔径0.45μm混合纤维素膜）后，以0.9%无菌氯化钠溶液冲洗滤膜2次（100ml/次），然后在第3次冲洗液（100ml0.9%无菌氯化钠溶液）中加入7.2项下制备的50～100cfu的试验菌，过滤。每株试验菌株平行制备2张滤膜。取出滤膜菌面朝上贴于胰酪大豆胨琼脂培养基平皿上，30～35℃倒置培养3天（金黄色葡
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萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌），或培养5天（白色念珠菌、黑曲霉），点计菌落数。 7.4.3.供试品对照组
取供试液1 ml，加至100 ml 0.9%无菌氯化钠溶液中，混匀，全量通过薄膜（孔径0.45μm混合纤维素膜）后，以0.9%无菌氯化钠溶液冲洗滤膜3次（100ml/次），平行制备2张滤膜。取出滤膜菌面朝上贴于胰酪大豆胨琼脂培养基平皿上，30～35℃倒置培养5天，点计菌落数。 7.4.4.菌液对照组
取0.9%无菌氯化钠溶液300 ml，200ml通过薄膜（孔径0.45μm混合纤维素膜）后，在余下的100ml0.9%无菌氯化钠溶液中加入7.2项下制备的50～100cfu的试验菌，过滤。每株试验菌株平行制备2张滤膜。取出滤膜菌面朝上贴于胰酪大豆胨琼脂培养基平皿上，30～35℃倒置培养3天（金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌），或培养5天（白色念珠菌、黑曲霉），点计菌落数。
7.4.5.稀释剂对照组
依照7.2项下菌液制备方法，以0.9%无菌氯化钠为稀释液，将各菌液稀释至含菌50～100cfu/ml，然后以500转/分钟离心3分钟，取上层菌液作下面的试验。
取上层菌液1 ml，加至100 ml 0.9%无菌氯化钠溶液中，混匀，全量通过薄膜（孔径0.45μm混合纤维素膜）后，以0.9%无菌氯化钠溶液冲洗滤膜3次（100ml/次），每株试验菌株平行制备2张滤膜。取出滤膜菌面朝上贴于胰酪大豆胨琼脂培养基平皿上，30～35℃倒置培养3天（金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌），或培养5天（白色念珠菌、黑曲霉），点计菌落数。 7.4.6. 离心沉淀-薄膜过滤法测定需氧菌总数方法验证的接受标准
试验组菌落数减去供试品对照组菌落数的值与菌液对照组菌落数的比值(即试验菌的回收率)应在0 .5?2 范围内，同时稀释剂对照组与菌液对照组菌落数的比值应也在0 .5?2 范围内。 7.4.7.离心沉淀-薄膜过滤法测定需氧菌总数方法验证的结果 试验次数1：
人工牛黄甲硝唑胶囊批号: ；胰酪大豆胨琼脂培养基配制批号： 培养箱 型号 编号 ；培养温度： ；培养时长：金黄色葡萄球菌、铜绿假单
胞菌、枯草芽孢杆菌3天，白色念珠菌、黑曲霉5天
菌试验菌株 种代数 1 2 均值 1 试验组 供试品对照组 1 2 菌液对照组 均值 稀释剂对照组 均值 试验组 各菌株回1 2 收率 稀释剂对照组各菌株回收率 金黄色 葡萄球菌 10 / 20
2015年版中国药典微生物限度检查方法验证方案
