胃癌中葡萄糖调节蛋白78的表达及其临床病理学意义
贺正希1，唐慧岚1，陈景飞1，陈文琳1，蒋炜峥1，谢远杰2*
【摘 要】 目的 检测葡萄糖调节蛋白78(GRP78)在胃癌组织中的表达，分析其临床病理学意义，探讨GRP78在胃癌发生发展中的作用。 方法 收集48例不同临床分期及不同分化程度胃腺癌及28例癌旁正常胃黏膜组织标本，分别应用RT-PCR、Western Blotting和免疫组化检测GRP78 mRNA和蛋白质的表达。 结果 与正常胃黏膜组织相比，胃癌组织中GRP78 mRNA及蛋白表达水平显著增加(P<0.05)。免疫组化检测GRP78阳性表达定位于胞浆，在正常胃粘膜组织中GRP78阳性表达率为10.7%(3/28)，高、中分化与低分化胃癌组织阳性表达率分别为59.4%(19/32)和93.8%(15/16)；直径≥5 cm的胃癌组织中GRP78阳性表达率(88.9%,16/18)高于直径<5 cm的胃癌组织(60%，18/30)，Ⅲ、Ⅳ期(TNM分期)病例胃癌组织中GRP78阳性表达率(90.5%，19/21)高于Ⅰ、Ⅱ期病例(55.6%，15/27)；5年内病情复发或者死亡病例胃癌组织中GRP78阳性表达率(82.8%，24/29)高于5年内病情无复发病例(52.6%，10/19)；淋巴结转移胃癌组织中GRP78阳性表达率(96.2%，25/26)明显高于非淋巴结转移胃癌组织(40.9%，9/22)，各组间差异均具有统计学意义(P<0.05)。 结论 GRP78在胃癌组织中高表达，其表达水平与胃癌肿瘤大小、分化程度、淋巴结转移、临床分期及预后密切相关。 【期刊名称】中南医学科学杂志 【年(卷),期】2015(000)001 【总页数】5
【关键词】 胃癌； 葡萄糖调节蛋白78； 分化； 淋巴结转移； 临床分期
·基础医学·
葡萄糖调节蛋白78(Glucose regulatory protein 78 KD,GRP78)是葡萄糖调节蛋白家族的重要成员，又称为免疫球蛋白重链结合蛋白，它作为一种分子伴侣参与蛋白质的折叠和转运，是正常状态下促进蛋白质成熟、调节细胞机能的重要物质。细胞在低氧等条件下发生内质网应激，诱导GRP78大量表达，因此GRP78蛋白成为内质网应激的标志性蛋白质。近来研究发现在肝癌[1]、胃癌[2]、乳腺癌[3]等多种肿瘤细胞中GRP78表达增高，表明GRP78的表达可能与肿瘤发生、发展有关，但具体作用机制尚未阐明，而且目前关于GRP78在胃癌组织中表达的临床病理意义存在分歧[4-6]。本研究通过RT-PCR、免疫组化和Western blotting等方法分别检测GRP78 mRNA和蛋白质在胃癌组织中的表达，分析其临床病理学意义，初步探讨GRP78表达与胃癌的关系，为进一步研究GRP78在胃癌发生、发展中的作用及其机制奠定基础。
1 材料与方法
1.1 组织标本和主要试剂
收集2011年10月～2013年10月南华大学附属第一医院行胃癌根治术后并建立电话随访的48例病例标本(一般病理特征见表1)，癌旁正常胃黏膜组织28例(癌旁5 cm以上)，其中高、中分化胃癌32例，低分化胃癌16例；伴淋巴结转移胃癌组织26例。手术标本取材后立即放入液氮罐保存，每例组织标本各取一部分经甲醛固定，制成石蜡切片，组织标本其余部分分别用于提取蛋白质和RNA。所有病例均经过病理学诊断证实，且术前均未接受放化疗。蛋白裂解液、BCA蛋白质定量试剂盒、蛋白marker、SP免疫组化试剂盒及DAB显色试剂盒购自北京中杉金桥生物技术公司。一步法RT-PCR试剂盒和DNA
marker购自碧云天生物技术公司。PVDF膜购自Millipore，GRP78兔抗人多克隆抗体、兔抗人β-actin单抗购自博士德生物技术公司；DEPC水和Trizol购自Invitrogen，GRP78、β-actin引物由上海华美生物工程公司合成。 1.2 RT-PCR检测胃癌组织中GRP78 mRNA的表达
取保存在液氮中各组胃组织标本，每例100 mg，采用Trizol-氯仿抽提总RNA，按RT-PCR试剂盒(Takara公司)说明合成cDNA，以cDNA为模板进行PCR扩增，GRP78
Primer:fwd(5′-GCACCACCTACTCGTGCGTT-3′)rev(5′-
ACCCAGGTGAGTATCTCCGTTAG-3′)，扩增片段长度为656 bp，PCR反应条件是：94 ℃ 4 min；94 ℃变性30 s,58 ℃退火60 s,70 ℃延伸2 min，36个循
环
；
70
℃
延
伸
6
min
。
β-actin
Primer:fwd(5′-
TGAGACCTTCAACACGCCG-3′) rev (5′-ATGGTGATGACCTGCCCGTC-3′)，扩增片段长度为378 bp，PCR反应条件是：94 ℃ 4 min；94 ℃变性45 s,56 ℃退火60 s,72 ℃延伸1.5 min，36个循环；72 ℃延伸8 min。反应后各取终产物10 μL经1.2%琼脂糖凝胶电泳后，用凝胶成像分析系统观察、分析实验结果，分别测出各组胃组织中GRP78及β-actin的积分吸光度(A)值，计算两者的比值，以此比值作为各组胃组织中GRP78 mRNA的相对表达量。 1.3 Western blotting检测胃癌组织中GRP78蛋白的表达
提取各组胃组织标本的总蛋白，BCA法测定蛋白浓度，样品和上样缓冲液以4∶1混合，SDS-PAGE电泳后，经半干转膜仪转到PVDF膜上，脱脂奶粉封闭1 h，分别加入GRP78兔抗人多克隆抗体(1∶300)和β-actin抗体(1∶1 000)，37 ℃孵育2 h，HRP标记Ⅱ抗孵育1 h，TBST洗脱3次，ECL化学发光显影，采用Quantity One软件测定各条带的吸光度值，分别以各条带与β-actin(内
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