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中南大学生物科学与技术学院
分子生物学研究中心
教 案
授课科目: 医学分子生物学 授课内容: 基因诊断与基因治疗 授课对象：临床医学五年制
授课时数： 4学时 授课教师：
授课地点：湘雅医学院新教学区 授课时间：
授课教材：医学分子生物学（21世纪高等院校教材），胡维新主编，北京：科学出版社，2007年2月，第一版；
生物化学，周爱儒 主编，人民卫生出版社，2005，第6版
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第三章 基因诊断与基因治疗 一、目的要求：
掌握：基因诊断的基本概念及特点；限制性酶谱分析法、RFLP、等位基因特异性
寡核苷酸探针杂交等方法的原理；PCR技术用于基因诊断的原理及特点；基因治疗的基本概念及特点；基因治疗的基本程序。
熟悉：PCR-SSCP分析、基因测序、基因芯片等用于基因诊断的原理及特点；基 因诊断的应用；基因治疗常用方法，包括反义RNA、核酶、三链DNA和RNA 干扰技术等。
了解：基因诊断和基因治疗的发展历史及前景。
二、讲授重点：
基因诊断和基因治疗的基本概念及特点；基因诊断的常用方法及应用原理；
基因治疗的常用方法及基本程序。
三、讲授难点：
限制性酶谱分析法、RFLP、PCR-ASO
探针杂交等方法的原理；PCR、PCR-SSCP
分析等用于基因诊断的原理。
四、教学方法：多媒体教学 五、教 具：多媒体课件 六、讲授内容：
第一节 基因诊断
一、基因诊断的概念及区别于其他诊断学的特点
基因诊断的出现：1976年加州大学华裔科学家 Kan YW用核酸分子杂交首次对一例α珠蛋白生成障碍性贫血进行诊断
狭义概念: 在基因（DNA或RNA)水平，用PCR、核酸杂交、基因重组、基因芯片等各种分子生物学技术检测特定基因存在与否、结构变异和表达状态的过程，对疾病作出诊断。
与传统诊断的区别：直接以病理基因（致病基因、疾病相关基因和外源性病原生物基因等）为分析对象，即对待诊生物材料某一（些）特定基因进行分析判断。
遗传物质改变：一是DNA或RNA水平变化，如病毒基因及其转录产物在体内从无到有、癌基因表达水平从低到高等；二是基因结构变化即突变，如点突变引起基因失活、染色体转位引起基因异常激活或灭活等。
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疾病或个体表型的本质
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生物遗传学基本规律 分子生物学技术与方法
二、基因诊断的常用技术方法
（一）应用核酸分子杂交可进行基因的特异识别和分析
核酸杂交的基本原理-----核酸变性和复性理论：（1）双链DNA分子在某些理化因素作用下解旋，条件恢复后又可恢复其双螺旋结构；（2）具有互补碱基序列的异源核酸单链之间同样可按碱基互补配对原则通过氢键结合为双链。
核酸杂交的基本过程：
Preparation of Samples and Probes Prehybridization and Hybridization Detection and Analysis of the Result 1.制备合适的探针
是核酸杂交用于基因诊断的关键 What is a probe?
标记的已知序列核酸片段，包括 DNA, cDNA, RNA, Oligonucleotide 针对具体情况选择合适的探针序列是基因诊断准确、特异、简便、可靠的基础。
2.不同形式的核酸分子杂交可用于不同的诊断目的 Southern blot:
Southern blot一般过程：
提取DNA→ 限制性内切酶消化DNA以产生特定长度的片段→凝胶电泳分离（DNA分子有其独特的限制性酶切图谱，所以经酶切消化和电泳分离后可在凝胶上形成特定的区带）→变性处理→DNA转印到膜上并使其牢固结合→预杂交及杂交→结果检测与分析 Northern blot
dot hybridization reverse dot hybridization
FISH: fluorescence in situ hybridization （二）PCR技术是基因诊断的一种基础技术
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PCR是在试管内利用DNA聚合酶催化的反应反复进行同一段
DNA片段合成的过程.N=N0(1+E）n N-扩增产物的量; N0-起始靶DNA分子数 E-扩增效率；n-循环次数。
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理论上，从一个模板分子起始，经过n次聚合反应后可合成2n
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个分子。如进行30轮扩增，则可合成出230，即109个待检分子；对一段500bp的DNA片段来说，约等于1 μg 。
PCR在基因诊断中的作用:从极少样品即可扩增出肉眼可见的产物。放大待诊信号，提高检测灵敏度。
PCR及其衍生技术：
1. 直接运用PCR扩增：异常缺失与存在
2. PCR产物的限制性酶谱分析（PCR-RE)和限制性片段长度多态性分析（PCR-RFLP)
PCR－RFLP：通过PCR将包含待测位点的DNA片段扩增后，用识别相应位点的限制性核酸内切酶水解，根据所产生限制性片段的数量和长度作出诊断。 用于已知突变位点的验证性诊断。
3. PCR-等位基因特异性寡核苷酸探针斑点杂交(PCR-ASO，PCR-DB) ASO: Allele Specific Oligonucleotide 1). wild probe vs mutant probe 2).已知突变的验证性检测
3).可区分纯合子和杂合子
4. PCR产物的反向点杂交分析（PCR-RDB ） RDB: Reverse Dot Blot 固定探针 5. PCR-单链构象多态性分析（PCR-SSCP)
将PCR产物变性为单链后进行非变性（中性）聚丙烯酰胺凝胶电泳，单个核苷酸的改变即可造成DNA单链构象的改变，进而导致电泳速率变化，从而检测出基因突变。
1）单链核酸碱基-构象-电泳速率 2）中性聚丙烯酰胺凝胶电泳
6. PCR-变性梯度凝胶电泳分析（PCR-DGGE） Denaturing Gradient Gel Electrophoresis 7. 甲基化特异性PCR
Methylation specific PCR, MS-PCR 模板甲基化处理：Na2SO3 C-U 需设计特异性甲基化引物G:C/A:U 8. 靶核酸的定量分析 Q-PCR, Quantitative PCR
基本原理：PCR指数扩增规律 N=N0(1+E）n PCR扩增有限性-平台期及平台效应（plateau effect）
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（1）测定PCR产物量：
梯度（系列）稀释法：先对已知量的靶
DNA进行梯度稀释（类似于比色）灰度扫描法 （2）极限稀释法
（3）非竞争性对照法 基本依据：同时扩增靶序列和内标序列（扩增 效率相似）
（4）竞争抑制法 （5）荧光标记探针法
分析：安全、简便快捷、多重检测
（三）DNA序列测定是最直接、最准确的基因诊断技术 例：序列分析用于基因诊断研究
病例SOX9基因HMG box内发生单碱基置换突变R178L(G→T)，如图所示，左侧正常对照第225位碱基为C，而该患儿为A（反义链中）
（四）DNA芯片技术是应用前景广阔的基因诊断技术（DNA chips) 生物芯片（biochip &bioarray)技术：
根据生物分子间特异性相互作用，将生化分析过程集成于芯片表面，从而实现对DNA、RNA、多肽、蛋白质等各种生物成分的高通量快速检测分析。
疾病诊断芯片 个性化用药芯片
基因诊断有其独特的优点
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第二节 基因诊断策略和应用 采用的技术：Southern印迹杂交
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限制性酶谱分析
限制性片段长度多态性分析 寡核苷酸探针杂交 PCR及其衍生技术 DNA芯片技术 高特异性：诊断目标 高灵敏度：分子生物学方法 结果稳定可靠：核酸的化学本质 早期诊断性：分子遗传学规律 应用广泛性：疾病与非疾病检查
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中南大学生物科学与技术学院分子生物学研究中心教案.doc
