实验40植物组织中过氧化氢含量及过氧化氢酶活性测定
实验40 植物组织中过氧化氢含量及过氧化氢酶活性测定
植物在逆境下或衰老时，由于体内活性氧代谢加强而使HO发生累积。HO可以直接2222或间接地氧化细胞内核酸，蛋白质等生物大分子，并使细胞膜遭受损害，从而加速细胞的衰老和解体。过氧化氢酶可以清除HO，是植物体内重要的酶促防御系统之一。因此，植物22
组织中HO含量和过氧化氢酶活性与植物的抗逆性密切相关。本实验用分光光度法测定过22
氧化氢含量，利用高锰酸钾滴定法和紫外吸收法测定过氧化氢酶活性。 一、过氧化氢含量的测定 【原理】
HO与硫酸钛(或氯化钛)生成过氧化物—钛复合物黄色沉淀，可被HSO溶解后，,224在415nm波长下比色测定。在一定范围内，其颜色深浅与HO浓度呈线性关系。 22
【仪器和用具】
研钵;移液管0.2ml×2支，5ml×1支;容量瓶10ml×7个，离心管5ml×8支;离心机;分光光度计。
【试剂】
100μmol/L HO丙酮试剂:取30%分析纯HO 57μl，溶于100ml，再稀释100倍;2222
mol/L硫酸;5%(W/V)硫酸钛;丙酮;浓氨水。 2 【方法】
1.制作标准曲线:取10ml离心管7支，顺序编号，并按表40-1加入试剂。
表40-1 测定HO浓度标准曲线配置表 22
离 心 管 号 试剂(ml) 1 2 3 4 5 6 7 100μmol/L HO 0 0.1 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 22
4?下预冷丙酮 1.0 0.9 0.8 0.6 0.4 0.2 0 5%硫酸钛 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 浓氨水 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2
3000r/min 离心10min，弃去上清夜，留沉淀 2mol 硫酸 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0
待沉淀完全溶解后，将其小心转入10ml容量瓶中，并用蒸馏水少量多次冲洗离心管，将洗涤液合并后定容至10ml刻度，415nm波长下比色。
2.样品提取和测定:(1)称取新鲜植物组织2~5g(视HO含量多少而定)，按材料与提22
取剂1?1的比例加入4?下预冷的丙酮和少许石英砂研磨成匀浆后，转入离心管3000 r/min下离心10min，弃去残渣，上清液即为样品提取液。(2)用移液管吸取样品提取液1ml，按表35-1加入5%硫酸钛和浓氨水，待沉淀形成后3000rpm/min离心10min，弃去上清液。沉淀用丙酮反复洗涤3,5次，直到去除植物色素。(3)向洗涤后的沉淀中加入2mol硫酸5ml，待完全溶解后，与标准曲线同样的方法定容并比色。
3.结果计算: CVt，
1FWV， 植物组织中HO含量(μmol/g Fw)= 22 式中 C—标准曲线上查得样品中HO浓度(μmol); 22 V—样品提取液总体积(ml); t V—测定时用样品提取液体积(ml); 1 FW—植物组织鲜重(g)。
二、过氧化氢酶的活性测定——高锰酸钾滴定法 【原理】
过氧化氢酶(CAT)属于血红蛋白酶，含有铁，它能催化过氧化氢分解为水和分子氧，在此过程中起传递电子的作用，过氧化氢则既是氧化剂又是还原剂。
, 2e
+2+3,R(Fe)+HO==R(Fe+OH) 22 , 2e
+3,+2R(FeOH)+HO==R(Fe)+2HO+O 222222
据此，可根据HO的消耗量或O的生成量测定该酶活力大小。在反应系统中加入一定222
量(反应过量)的HO溶液，经酶促反应后，用标准高锰酸钾溶液(在酸性条件下)滴定22
多余的HO22
5HO+2KMnO+4HSO5O+2KHSO+8HO+2MnSO 22424 2424 即可求出消耗的HO的量。 22 【仪器和用具】
研钵;三角瓶50ml×4;酸式滴定管(10ml);恒温水浴;容量瓶25ml×1。 【试剂】
10% HSO;0.2mol/L磷酸缓冲液pH7.8; 24
0.1mol/L高锰酸钾标准液:称取KMnO(AR)3.1605g，用新煮沸冷却蒸馏水配制成4
1000ml，用0.1mol/L草酸溶液标定;
0.1mol/L HO:市售30% HO大约等于17.6mol/L，取30% HO溶液5.68ml，稀释至2222221000ml，用标准0.1mol/ KMnO溶液(在酸性条件下)进行标定; 4
0.1mol/L草酸:称取优级纯HCO?2HO 12.607g，用蒸馏水溶解后，定容至1L。 224 2
【方法】
1.酶液提取 取小麦叶片2.5g加入pH7.8的磷酸缓冲溶液少量，研磨成匀浆，转移至25ml容量瓶中，用该缓冲液冲洗研钵，并将冲洗液转入容量瓶中，用同一缓冲液定容，4000rpm离心15min，上清液即为过氧化氢酶的粗提液。
2.取50ml三角瓶4个(两个测定两个对照)，测定瓶中加入酶液2.5ml，对照瓶中加入煮死酶液2.5ml，再加入2.5ml 0.1mol/L HO，同时计时，于30?恒温水浴中保温10min，22
立即加入10% HSO 2.5ml。 24
3.用0.1mol/L KMn,标准溶液滴定HO，至出现粉红色(在30min内不消失)为终点。 422
4.结果计算:
酶活性用每克鲜重样品1min内分解HO的毫克数表示: 22 ().ABV,，，T17
FWVt，，1 酶活(mgHO/gFW?min)= 22 式中 A—对照KMnO滴定毫升数; 4 B—酶反应后KMnO滴定毫升数; 4 V—酶液总量(ml); T V—反应所用酶液量(ml); 1 W—样品鲜重(g);
1.7—1ml 0.1mol/L的KMnO相当于1.7mg HO。 422 【注意】
所用KMnO溶液及HO溶液临用前要经过重新标定。 422
三、过氧化氢酶的活性测定——紫外吸收法 【原理】
HO在240nm波长下有强烈吸收，过氧化氢酶能分解过氧化氢，使反应溶液吸光度(A)22240随反应时间而降低。根据测量吸光率的变化速度即可测出过氧化氢酶的活性。
【仪器与用具】
紫外分光光度计;离心机;研钵;250ml容量瓶1个;0.5ml刻度吸管2支，2ml刻度吸管1支;10ml试管3支;恒温水浴;
【试剂】
0.2mol/L pH7.8磷酸缓冲液(内含1%聚乙烯吡咯烷酮); 0.1mol/L HO(用0.1mol/L高锰酸钾标定)。 22 【方法】
1.酶液提取:称取新鲜小麦叶片或其它植物组织0.5g置研钵中，加入2,3ml 4?下预冷的pH7.0磷酸缓冲液和少量石英砂研磨成匀浆后，转入25ml容量瓶中，并用缓冲液冲洗研钵数次，合并冲洗液，并定容到刻度。混合均匀将量瓶置5?冰箱中静置10min，取上部澄清液在4000rpm下离心15min，上清液即为过氧化氢酶粗提液。5?下保存备用。
2.测定:取10ml试管3支，其中2支为样品测定管，1支为空白管，按表40-2顺序加入试剂。
表40-2 紫外吸收法测定HO样品液配置表 22 管 号 S1 S2 S3 粗酶液(ml) 0.0 0.2 0.2 pH7.8磷酸(ml) 1.5 1.5 1.5 蒸馏水(ml) 1.0 1.0 1.0
25?预热后,逐管加入0.3ml 0.1mol/L的HO，每加完一管立即记时，并迅速倒入石英22
比色杯中，240nm下测定吸光度，每隔1min读数1次，共测4min，待3支管全部测定完后，按下式计算酶活性。
3.结果计算:
以1min内A减少0.1的酶量为1个酶活单位(u)。240A，V,T
0.1，V1，t，FW 过氧化氢酶活性(u/gFW/min)= ，()AASS12
2式中 A= A, ,240 S0
A—加入煮死酶液的对照管吸光值; S0 A, A—样品管吸光值; S1S2 Vt—粗酶提取液总体积(ml); V—测定用粗酶液体积(ml); 1 FW—样品鲜重(g);
0.1—A每下降0.1为1个酶活单位(u); 240 t—加过氧化氢到最后一次读数时间(min)。 【注意事项】
凡在240nm下有强吸收的物质对本实验有干扰。 【思考题】
1.影响过氧化氢酶活性测定的因素有哪些? 2.过氧化氢酶与哪些生化过程有关?
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实验40植物组织中过氧化氢含量及过氧化氢酶活性测定
