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9、平板划线法只能得到单个的菌落，不能计数。划线时不要将最后一区的与第一区 相连。
操作的第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物；每次 划线之前都要灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后，接种环上残留的菌种，使每次划 线时菌种的数目逐渐减少；划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环是为了杀死接种环上 残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。
在作第二次以及其后的划线操作时，为什么总是从上一次划线的末端开始划线？ 答：划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开 始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来 的菌落。
10、稀释涂布平板法不仅能得到单个的菌落，还能计数。
稀释涂布的所有操作都应在火焰附近进行。涂布器浸在酒精中，然后灼烧。 11、菌种保存
频繁使用：临时保藏（接种到试管的固体斜面培养基上， 要重新将菌种从旧的培养基上转移到新鲜的培养基上。）
长期保存：甘油管藏（－ 20℃的冷冻箱中）。
课题二 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
1、尿素：只有当土壤中的细菌将尿素分解成氨之后，才能被植物利用。土壤中的细 菌之所以能分解尿素，是因为他们能合成脲酶。
2、微生物的筛选应用的原理：人为提供有利于目的菌株生长的条件（包括营养、温 度、pH等），同时抑制或阻止其他微生物生长。
3、测定微生物数量的常用方法：稀释涂布平板法（一般设置
3～5 个平板，选择菌 4℃冰箱，每 3～6 个月，
落数在 30～300 的平板进行计数，并取平均值。统计的菌落数往往比活菌的实际数目 低，）和显微镜直接计数、滤膜法。
4、流程：土壤取样（在距地表约
3～8cm 的土壤层取样，取样用具需灭菌）→样品
30~37℃1~2 天；放
的稀释（稀释程度细菌 >放线菌 >真菌）→微生物的培养与观察（细菌 线菌 25~28℃5~7 天；霉菌 25~28℃3~4 天）
5、菌落特征：形状、大小、隆起程度、颜色。 6、计算公式：
每克样品中的菌落数 =（C/V ）*M 其中， C 代表某一稀释度下平板上生长的平均菌 落数， V 代表涂布平板时所用的稀释液的体积（
ml），M 代表稀释倍数
pH升高）
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7、鉴别方法：加酚红指示剂，变红（细菌合成的脲酶将尿素分解成氨，
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课题三 分解纤维素的微生物的分离
1、棉花是自然界中纤维素含量最高的天然产物，商品纤维素：水溶性的羧甲基纤维 素钠（ CMC—Na）、不溶于水的微晶纤维素（
2、纤维素酶是一种复合酶，包括
Avicel ）。
C1 酶、 CX 酶和葡萄糖苷酶，前两种酶使纤维素分
解成纤维二糖，第三种酶将纤维二糖分解成葡萄糖。
3、筛选方法——刚果红（ CR）染色法。
刚果红与纤维素等多糖物质形成红色复合物，但并不和纤维二糖和葡萄糖发生这
种反应。当纤维素被纤维素酶分解后，刚果红－纤维素的复合物就无法形成，培养基中 会出现以纤维素分解菌为中心的透明圈。这样，我们就可以通过是否产生透明圈来筛选 纤维素分解菌。
一种是先培养微生物，再加入刚果红进行颜色反应（先加
Nacl ，目的是洗去结合不牢的 入 CR，混匀后倒平板）。
方法一缺点是操作繁琐，加入刚果红溶液会使菌落之间发生混杂；其优点是显示出 的颜色反应的就是纤维素分解菌。方法二的优点是操作简便，不存在菌落混杂问题，缺 点是显示出的颜色反应的可能是纤维素分解菌或淀粉分解菌；另一缺点是：有些微生物 具有降解色素的能力，它们在长时间培养过程中会降解刚果红形成明显的透明圈，使纤 维素分解菌不易区分。
4、分离分解纤维素的微生物的实验流程 土壤取样（可将滤纸埋在土壤） 布到鉴别纤维素分解菌的培养基上
→ 选择培养（此步可省略） → 梯度稀释 → 将样品涂
CR，倒去 CR 后再加
CR）；另一种是在倒平板时就加入刚果红（在培养基中加
→ 挑选产生透明圈的菌落
5、对分解纤维素的微生物进行了初步的筛选后，只是分离纯化的第一步，为确定得 到的是纤维素分解菌，还需要进行发酵产纤维素酶的实验，纤维素酶的发酵方法有液体 发酵和固体发酵两种。纤维素酶的测定方法，一般是对纤维素酶分解滤纸等纤维素后所 产生的葡萄糖进行定量的测定。
专题三 植物的组织培养技术 课题一 菊花的组织培养
1、愈伤组织：细胞排列疏松而无规则，是一种高度液泡化的呈无定形状态的薄壁细 胞。
2、脱分化：由高度分化的植物组织或细胞产生愈伤组织的过程，也叫去分化。 3、再分化：脱分化产生的愈伤组织继续进行培养，又可以重新分化成根或芽等器官
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的过程。
4、植物组织培养的基本过程 离 体 的 植 物 组 织、器官或细胞
组织培养
脱分化
愈伤组织
组织培养
再分化
根、芽 等器官
人为使用植物激素控制
移植
——→试管苗———→完整的植物体
5、影响植物组织培养的因素
①材料：植物的种类、材料的年龄和保存时间的长短等都会影响实验结果。菊花组 织培养一般选择未开花植物的茎上部新萌生的侧枝。培育无病毒作物，选茎尖分生区细 胞。
②营养： MS 培养基（含有大量元素、微量元素、有机物） ③激素： 使用顺序 先生长素，
后细胞分裂素 先细胞分裂素，
后生长素
实验结果 有利于分裂 但不分化 细胞既分裂
也分化 分化频率提
高
pH5.8，温度 18~22℃，并且每日用 比值高时
比值低时
生长素／ 细胞分裂素比值与结果
促根分化， 抑芽形成 促芽分
化， 抑根形成
比值适中
促进愈伤组织生长
同时使用
④环境条件： PH、温度、光等。菊花的组织培养， 日光灯照射 12h。.
6、菊花组织培养的操作流程
①配制 MS固体培养基（配制各种母液 4℃保存，大量元素浓缩 10 倍，微量元素浓
缩 100 倍，使用时根据母液的浓缩倍数，计算用量；配制培养基，可以不添加植物激 素；高压蒸汽灭菌）→②外植体的消毒（流水冲洗→洗衣粉 +软刷刷洗→流水冲洗 20min →无菌吸水纸吸干外植体表面→体积分数为 70%的酒精中摇动 2～3 次，持续 6~7s→无菌 水清洗→无菌吸水纸吸干外植体表面→质量分数为 0.1 ﹪的氯化汞溶液中 1～2min→无菌 水中至少清洗 3 次；既要考虑药剂的消毒效果，又要考虑植物的耐受能力）→③接种 （无菌操作，形态学上端朝上）→
④ 培养（无菌箱， 18~22℃，光照 12h）→⑤移栽（先
打开培养瓶的封口膜，生长几日；然后用流水清洗根部培养基，移植到消过毒的蛭石或
珍珠岩中进行壮苗。最后露天栽培）→⑥栽培
7、微生物培养基以 有 机营养为主， MS 培养基则需提供大量无机营养。
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专题二 月季的花药培养
1、花粉发育过程： 小孢子母细胞（ 2n）
减数分裂
小孢子四分体时期（ n） 单核居中期（ n）
有丝分裂 单核靠边期（ n）
双核期
2、产生花粉植株的两种途径：一种是花粉通过胚状体阶段发育为植物，另一种是花 粉在诱导培养基上先形成愈伤组织，再将其诱导分化成植株。这两种途径之间并没有绝 对的界限，主要取决于培养基中激素的种类及其浓度配比。
①先诱导生芽，再诱导生根；②胚状体又称为细胞胚。
3、影响花药培养的因素：材料的选择与培养基的组成是主要的影响因素。亲本植株 的生长条件、材料的低温预处理以及接种密度等对诱导成功率都有一定影响
选初花期、完全未开放的花蕾、单核
( 靠边) 期花粉。 2 个精子 (n)
有丝分裂
生殖细胞（ n） 生殖细胞核（ n）
营养细胞（ n） 花粉管细胞核（ n）
4、月季的花药培养过程：材料的选取→材料的消毒→接种和培养 ①选择花药用镜检法。最常用醋酸洋红法（紫红色）、焙花青 ②材料的消毒： 花 蕾
70%酒精
无菌水
30s
无菌吸水纸
2～4min 0.1%氯化汞
无菌水
- 铬矾法（蓝黑色）。
清洗 吸干水分 冲洗 清洗
③每瓶接种花药 7～10 个, 温度 25℃,pH5.8 ，不需要光照 . 幼小植株形成后才需要光 照。
在剥离花药时，要尽量不损伤花药（否则接种后容易从受伤部位产生愈伤组织）， 同时还要彻底去除花丝，因为与花丝相连的花药不利于愈伤组织或胚状体的形成。
花药开裂 , 若是长出愈伤组织，要将愈伤组织及时转移到分化培养基上，以便进一步 分化出再生植株。若是胚状体，则一个花药内就会产生大量幼小植株，须尽快将其分 开，分别移植到新的培养基上，否则这些植株将很难分开。
专题四 酶的研究与应用
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高中生物教材选修一必背 - 图文
