第十一章 血清学试验
第六节 免疫标记技术
免疫标记技术是利用抗原抗体反应的特异性和标记分子极易检测的高度敏感性相结合形成的试验技术。免疫标记技术主要有荧光抗体标记技术、酶标抗体技术和同位素标记抗体技术。它们的敏感性和特异性大大超过常规血清学方法，现已广泛用于传染病的诊断、病原微生物的鉴定、分子生物学中基因表达产物分析等领域。其中酶标抗体技术最为简便，应用较广。这里主要介绍荧光抗体标记技术和酶标抗体技术。
一、荧光抗体标记技术
荧光抗体标记技术（fluorescent-labelled antibody technicque）是用荧光色素标记在抗体或抗原上，与相应的抗原或抗体特异性结合，然后用荧光显微镜观察所标记的荧光，以分析示踪相应的抗原或抗体的方法。
（一）原理 荧光素在10-6的超低浓度时，仍可被专门的短波光源激发，在荧光显微镜下可观察到荧光。荧光抗体标记技术就是将抗原抗体反应的特异性、荧光检测的高敏性、以及显微镜技术的精确性三者结合的一种免疫检测技术。
（二）荧光色素 荧光色素是能产生明显荧光，又能作为染料使用的有机化合物。主要是以苯环为基础的芳香族化合物和一些杂环化合物。它们受到激发光(如紫外光)照射后，可发射荧光。
可用于标记的荧光色素有异硫氰酸荧光黄(FITC)、四乙基罗丹明(RB 200)和四甲基异硫氰酸罗丹明（TMRITC）。其中FITC应用最广，为黄色结晶，最大吸收光波长为490～495nm,最大发射光波长520～530nm，可呈现明亮的黄绿色荧光。FITC分子中含有异硫氰基，在碱性(pH9.0～9.5)条件下能与IgG分子的自由氨基结合，形成FITC-IgG结合物，从而制成荧光抗体。
抗体经荧光色素标记后，不影响与抗原的结合能力和特异性。当荧光抗体与相应的抗原结合时，就形成了带有荧光性的抗原抗体复合物，从而可在荧光显微镜下检出抗原的存在。
（三）荧光抗体染色及荧光显微镜检查
1．标本片的制备 标本制作的要求首先是保持抗原的完整性，并尽可能减少形态变化，抗原位置保持不变。同时还必须使抗原标记抗体复合物易于接受激发光源，以便很好地观察和记录。这就要求标本要相当薄，并要有适宜的固定处理方法。
根据被检样品的不同，采用不同的制备方法。细菌培养物、血液、脓汁、粪便、尿沉渣及感染的动物组织等，可制成涂片或压印片。感染组织最好制成冰冻切片或低温石蜡切片。也可用生长在盖玻片上的单层细胞培养作标本。
标本的固定有两个目的，一是防止被检材料从玻片上脱落，二是消除抑制抗原抗体反应的因素。最常用的固定剂是丙酮和95%的乙醇。固定后用PBS反复冲洗，干后即可用于染色。
2．染色方法 荧光抗体染色法有多种类型，常用的有直接法和间接法两种。
（1）直接法 取待检抗原的标本片，滴加荧光抗体染色液于其上，置湿盒中，于37℃作用30min，用pH7.2的PBS液漂洗15min，冲去游离的染色液，干燥后滴加缓冲甘油（分析纯甘油9份加PBS 1份）封片，在荧光显微镜下观察。标本片中若有相应抗原存在，即可与荧光抗体结合，在镜下见有荧光抗体围绕在受检的抗原周围，发出黄绿色荧光（图11-8）。直接法应设以下对照，标本自发荧光对照，阳性标本和阴性标本对照。该方法优点是简便、特异性高，非特异性荧光染色少。缺点是敏感性偏低，而且每检一种抗原就需要制备一种荧光抗体。
（2）间接法 取待检抗原的标本，首先滴加特异性抗体，置湿盒中，于37℃作用30min，用pH7.2的PBS液漂洗后，再滴加荧光色素标记的第2抗体(抗抗体)染色，再置湿盒中，于37℃作用30min，用PBS液漂洗，干燥后封片镜检。阳性者形成抗原-抗体-荧光抗抗体复合物,发黄绿色荧光（图11-9）。间接法对照除自发荧光、阳性和阴性对照外，首次试验时应设无中间层对照（标本加标记抗抗体）和阴性血清对照（中间层用阴性血清代替特异性抗血清）。
间接法的优点是，比直接法敏感，对一种动物而言，只需制备一种荧光抗抗体，即可用于多种抗原或抗体的检测，镜检所见荧光也比直接法明亮。
（3）抗补体法 将抗血清与补体等量混合，滴加于待检抗原的标本片上，使其形成抗原-抗体-补体复合物，漂洗后再滴加荧光标记的抗补体抗体染色液，感作一定时间，漂洗、干燥后镜检。此法特异性和敏感性均高，但易产生非特异性荧光。
3．荧光显微镜检查 标本滴加缓冲甘油后用盖玻片封载，即可在荧光显微镜下观察。荧光显微镜不同于光学显微镜之处，在于它的光源是高压汞灯或溴钨灯，并有一套位于集光器与光源之间的激发滤光片，它只让一定波长的紫外光及少量可见光（蓝紫光）通过。此外，还有一套位于目镜内的屏障滤光片，只让激发的荧光通过，而不让紫外光通过，以保护眼睛并能增加反差。为了直接观察微量滴定板中的抗原抗体反应，如感染细胞培养物上的荧光，可使用现已有商品的倒置荧光显微镜观察。
（四）荧光抗体标记技术的应用 荧光抗体标记技术具有快速、操作简单的特点，同时又有较高的敏感性、特异性和直观性，已广泛用于细菌、病毒、原虫的鉴定和传染病的快速诊断。此外还可用于淋巴细胞表面抗原的测定和自身免疫病的诊断等方面。
1．细菌病诊断 能利用荧光抗体标记技术直接检出或鉴定的细菌约有30余种，均具有较高的敏感性和特异性，其中较常应用的是链球菌、致病性大肠杆菌、沙门氏菌、马鼻疽杆菌、猪丹毒杆菌等。动物的粪便、黏膜拭子涂片、病变部渗出物、体液或血液涂片、病变组织的触片或切片以及尿沉渣均可作为检测样本，经直接法检出目的菌，这对于细菌病的诊断具有很高的价值。
2．病毒病诊断 用荧光抗体标记技术直接检出患畜病变组织中的病毒，已成为病毒感染快速诊断的重要手段，如猪瘟、鸡新城疫等可取感染组织做成冰冻切片或触片，用直接或间接免疫荧光染色可检出病毒抗原，一般可在2h内作出诊
断报告；猪流行性腹泻在临床上与猪传染性肠胃炎十分相似，将患病小猪小肠冰冻切片，用猪流行性腹泻病毒的特异性荧光抗体做直接免疫荧光检查，即可对猪流行性腹泻进行确诊。
二、酶标抗体技术
酶标抗体技术（enzyme-labelled antibody technicque）是继免疫荧光技术之后发展起来的一大新型的血清学技术，目前该技术已成为免疫诊断、检测和分子生物学研究中应用最广泛的免疫学方法之一。 （一）原理 酶标抗体技术是根据抗原抗体反应的特异性和酶催化反应的高度敏感性而建立起来的免疫检测技术。酶是一种有机催化剂，催化反应过程中不被消耗，能反复作用，微量的酶即可导致大量的催化过程，如果产物为有色可见产物，则极为敏感。
酶标抗体技术的基本程序是：①将酶分子与抗原或抗体分子共价结合，这种结合既不改变抗体的免疫反应活性，也不影响酶的催化活性。②将此种酶标记的抗体（抗抗体）与存在于组织细胞或吸附在固相载体上的抗原（抗体）发生特异性结合，并洗下未结合的物质。③滴加底物溶液后，底物在酶作用下水解呈色；或者底物不呈色，但在底物水解过程中由另外的供氢体提供氢离子，使供氢体由无色的还原型变为有色的氧化型，呈现颜色反应。因而可通过底物的颜色反应来判定有无相应的免疫反应发生。颜色反应的深浅与标本中相应抗原（抗体）的量呈正比。此种有色产物可用肉眼或在光学显微镜或电子显微镜下看到，或用分光光度计加以测定。这样，就将酶化学反应的敏感性和抗原抗体反应的特异性结合起来，用以在细胞或亚细胞水平上示踪抗原或抗体的所在部位，或在微克、纳克水平上测定它们的量。所以，本法既特异又敏感，是目前应用最为广泛的一种免疫检测方法之一。
（二）用于标记的酶 用于标记的酶有辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酶、葡萄糖氧化酶等，其中以HRP应用最广泛，其次是碱性磷酸酶。HRP广泛分布于植物界，辣根中含量最高。HRP是由无色的酶蛋白和深棕色的铁卟啉构成的一种糖蛋白，分子量为40 000。HRP的作用底物是过氧化氢，常用的供氢体有邻苯二胺(0PD)和3,3,-二氨基联苯胺(DAB)，二者作为显色剂。因为它们能在HRP催化H2O2生成H2O过程中提供氢，而自己生成有色产物。
OPD氧化后形成可溶性产物，呈橙色，最大吸收波长为492nm，可用肉眼判定。OPD不稳定，须现用现配，常作为酶联免疫吸附试验中的显色剂。OPD有致癌性，操作时应予注意。DAB反应后形成不溶性的棕色物质，可用光学显微镜和肉眼观察，适用于各种免疫酶组织化学染色法。
HRP可用戊二醛交联法或过碘酸盐氧化法将其标记于抗体分子上制成酶标抗体。生产中常用的酶标抗体技术有免疫酶组织化学染色法和酶联免疫吸附试验两种。
（三）免疫酶组织化学染色技术 又称免疫酶染色法。是将酶标记的抗体应用于组织化学染色，以检测组织和细胞中或固相载体上抗原或抗体的存在及其分
布位置的技术。（图11-10）。
1．标本制备和处理 用于免疫酶染色的标本有组织切片（冷冻切片或低温石蜡切片）、组织压印片、涂片以及细胞培养的单层细胞盖片等。这些标本的制备和固定与荧光抗体技术相同，但尚要进行一些特殊处理。
用酶结合物作细胞内抗原定位时，由于组织和细胞内含有内源性过氧化酶，可与标记在抗体上的过氧化物酶在显色反应上发生混淆。因此，在滴加酶结合物之前通常将制片浸于0.3% H2O2中室温处理15～30min，以消除内原酶。应用1%～3%H2O2甲醇溶液处理单纯细胞培养标本或组织涂片，低温条件下作用10～15min，可同时起到固定和消除内原酶的作用，效果比较好。
组织成分对球蛋白的非特异性吸附所致的非特异性背景染色，可用10%卵蛋白作用30min进行处理，用0.05%吐温-20和含1%牛血清白蛋白（BSA）的PBS对细胞培养标本进行处理，同时可起到消除背景染色的效果。
2．染色方法 可采用直接法、间接法、抗抗体搭桥法、杂交抗体法、酶抗酶复合物法、增效抗体法等各种染色方法，其中直接法和间接法最常用。反应中每加一种反应试剂，均需于37℃作用30min，然后以PBS反复洗涤三次，以除去未结合物。
（1）直接法 以酶标抗体处理标本，然后浸入含有相应底物和显色剂的反应液中，通过显色反应检测抗原抗体复合物的存在。 （2）间接法 标本首先用相应的特异性抗体处理后，再加酶标记的抗抗体，然后经显色揭示抗原-抗体-抗抗体复合物的存在。
3．显色反应 免疫酶组化染色中的最后一环是用相应的底物使反应显色。不同的酶所用底物和供氢体不同。同一种酶和底物如用不同的供氢体，则其反应物的颜色也不同。如辣根过氧化物酶，在组化染色中最常用DAB，用前应以0.05%mol/L,pH7.4～7.6的Tris-HCl缓冲液配成50～75mg/100ml溶液，并加少量（约0.01%～0.03%）H2O2混匀后加于反应物中置室温10～30min，反应产物呈深棕色；如用甲萘酚，则反应产物呈红色，用4-氯-1-萘酚,则呈浅蓝色或蓝色。 4．标本观察 显色后的标本可在普通显微镜下观察，抗原所在部位DAB显色呈棕黄色。亦可用常规染料作反衬染色，使细胞结构更为清晰，有利于抗原的定位。本法优于免疫荧光抗体技术之处，在于毋须应用荧光显微镜，且标本可以长期保存。
（四）酶联免疫吸附试验(Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA) ELISA是应用最广、发展最快的一项新技术。其基本过程是将抗原(或抗体)吸附于固相载体，在载体上进行免疫酶反应，底物显色后用肉眼或分光光度计判定结果。
1．固相载体 有聚苯乙烯微量滴定板、聚苯乙烯球珠等。聚苯乙烯微量滴定板（40孔或96孔板）是目前最常用的载体，小孔呈凹形，操作简便，有利于大批样品的检测。新板在应用前一般无需特殊处理，直接使用或用蒸馏水冲洗干净，自然干燥后备用。一般均一次性使用，如用已用过的微量滴定板，需进
行特殊处理。
用于ELISA的另一种载体是聚苯乙烯珠，由此建立的ELISA又称微球ELISA。珠的直径0.5～0.6cm,表面经过处理以增强其吸附性能，并可做成不同颜色。此小珠可事先吸附或交联上抗原或抗体，制成商品。检测时将小球放人特制的凹孔板或小管中，加入待检标本将小珠浸没进行反应，最后在底物显色后比色测定。本法现已有半自动化装置，用以检验抗原或抗体，效果良好。
2．包被 将抗原或抗体吸附于固相表面的过程，称载体的致敏或包被。用于包被的抗原或抗体，必须能牢固地吸附在固相载体的表面，并保持其免疫活性。大多数蛋白质可以吸附于载体表面，但吸附能力不同。可溶性物质或蛋白质抗原，例如病毒蛋白、细菌脂多糖、脂蛋白、变性的DNA等均较易包被上去。较大的病毒、细菌或寄生虫等难以吸附，需要将它们用超声波打碎或用化学方法提取抗原成分，才能供试验用。
用于包被的抗原或抗体需纯化，纯化抗原和抗体是提高ELISA敏感性与特异性的关键。抗体最好用亲和层析和DEAE纤维素离子交换层析方法提纯。有些抗原含有多种杂蛋白，须用密度梯度离心等方法除去，否则易出现非特异性反应。
蛋白质(抗原或抗体)很易吸附于未使用过的载体表面，适宜的条件更有利于该包被过程。包被的蛋白质数量通常为1～10μg/ml。高pH值和低离子强度缓冲液一般有利于蛋白质包被，通常用0.1mol/L pH9.6碳酸盐缓冲液作包被液。一般包被均在4℃过夜，也有经37℃2～3h达到最大反应强度。包被后的滴定板可置于4℃冰箱，可贮存3周。如真空塑料封口，于-20℃冰箱可贮存更长时间。用时充分洗涤。
3．洗涤 在ELISA的整个过程中，需进行多次洗涤，目的是防止重叠反应，避免引起非特异吸附现象。因此，洗涤必须充分。通常采用含助溶剂吐温-20(最终质量分数为0.05%)的PBS作洗涤液。洗涤时，先将前次加入的溶液倒空，吸干，然后加入洗涤液洗涤3次，每次3min，倒空，并用滤纸吸干。
4．试验方法 ELISA的核心是利用抗原抗体的特异性吸附，在固相载体上一层层地叠加，可以是两层、三层甚至多层。整个反应都必须在抗原抗体结合的最适条件下进行。每层试剂均稀释于最适和抗原抗体反应的稀释液(0.01～0.05mol/L pH7.4 PBS中加吐温-20至0.05%，10%犊牛血清或1%BSA)中，加入后置4℃过夜或37℃1～2h。每加一层反应后均需充分洗涤。阳性、阴性应有明显区别。阳性血清颜色深，阴性血清颜色浅，二者吸收值的比值最大时的浓度为最适浓度，试验方法主要有以下几种（图11-11）。
（1）间接法 用于测定抗体。用抗原包被固相载体，然后加入待检血清样品，经孵育一定时间后，若待检血清中含有特异性的抗体，即与固相载体表面的抗原结合形成抗原-抗体复合物。洗涤除去其他成分，再加上酶标记的抗抗体，反应后洗涤，加入底物，在酶的催化作用下底物发生反应，产生有色物质。样品中含抗体越多，出现颜色越快越深。
（2）夹心法 又称双抗体法，用于测定大分子抗原。将纯化的特异性抗体
第六节 免疫标记技术
