第六章 基因预测和基因结构分析
人们获得各种核酸和蛋白质序列的目的是了解这个序列在生物体中充当了怎样的角色。例如，DNA序列中重复片段、编码区、启动子、内含子/外显子、转录调控因子结合位点等信息；蛋白质的分子量、等电点、二级结构、三级结构、四级结构、膜蛋白的跨膜区段、酶的活性位点、以及蛋白质之间相互作用等结构和功能信息。虽然用实验的方法是多年以来解决这类问题的主要途径，但新的思路是利用已有的对生物大分子结构和功能特性的认识，用生物信息学的方法通过计算机模拟和计算来“预测”出这些信息或提供与之相关的辅助信息。由于生物信息学的特点，可以用较低的成本和较快的时间就能获得可靠的结果。近10年来生物学序列信息的爆炸性增长大大促进了各种序列分析和预测技术的发展，目前已经可以用理论预测的方法获得大量的结构和功能信息。要注意的是，尽管各种预测方法都基于现有的生物学数据和已有的生物学知识，但在不同模型或算法基础上建立的不同分析程序有其一定的适用范围和相应的限制条件，因此最好对同一个生物学问题尽量多用几种分析程序，综合分析各种方法得到的结果和结果的可靠性。此外，生物信息学的分析只是为生物学研究提供参考，这些信息能提高研究的效率或提供研究的思路，但很多问题还需要通过实验的方法得到验证。 在构建一个基因结构预测模型时，一些主要问题是值得注意的：（1）对真核生物序列，遮蔽重复序列应先于其它分析过程；（2）大多程序都有特定生物物种适用性；（3）许多程序只能特定适用于基因组DNA数据或者只适用于cDNA的数据；（4）序列的长度也是一个重要因素。
6.1针对核酸序列的预测方法
针对核酸序列的预测就是在核酸序列中寻找基因，找出基因的位置和功能位点的位置，以及标记已知的序列模式等过程。在此过程中，确认一段DNA序列是一个基因需要有多个证据的支持。一般而言，在重复片段频繁出现的区域里，基因编码区和调控区不太可能出现；如果某段DNA片段的假想产物与某个已知的蛋白质或其它基因的产物具有较高序列相似性的话，那么这个DNA片段就非常可能属于外显子片段；在一段DNA序列上出现统计上的规律性，即所谓的“密码子偏好性”，也是说明这段DNA是蛋白质编码区的有力证据；其它的证据包括与“模板”序列的模式相匹配、简单序列模式如TATA Box等相匹配等。一般而言，确定基因的位置和结构需要多个方法综合运用，而且需要遵循一定的规则：对于真核生物序列，在进行预测之前先要进行重复序列分析，把重复序列标记出来并除去；选用预测程序时要注意程序的物种特异性；要弄清程序适用的是基因组序列还是cDNA序列；很多程序对序列长度也有要求，有的程序只适用于长序列，而对EST这类残缺的序列则不适用。
6.1.1 重复序列分析
对于真核生物的核酸序列而言，在进行基因辨识之前都应该把简单的大量的重复序列标记出来并除去，因为很多情况下重复序列会对预测程序产生很大的扰乱，尤其是涉及数据库搜索的程序。常见的重复序列分析程序有GrailEXP等，可以在Web界面上使用这些程序，或者用Email来进行。
6.1.2 数据库搜索
把未知核酸序列作为查询序列，在数据库里搜索与之相似的已有序列是序列分析
预测的有效手段，在上一节中已经专门介绍了序列比对和搜索的原理和技术。但值得注意的是，由相似性分析作出的结论可能导致错误的流传；有一定比例的序列很难在数据库里找到合适的同源伙伴。对于EST序列而言，序列搜索将是非常有效的预测手段。
6.1.3 编码区统计特性分析
统计获得的经验说明，DNA中密码子的使用频率不是平均分布的，某些密码子会以较高的频率使用而另一些则较少出现。这样就使得编码区的序列呈现出可察觉的统计特异性，即所谓的“密码子偏好性”。利用这一特性对未知序列进行统计学分析可以发现编码区的粗略位置。这一类技术包括：双密码子计数(统计连续两个密码子的出现频率)；核苷酸周期性分析(分析同一个核苷酸在3,6,9,...位置上周期性出现的规律)；均一/复杂性分析(长同聚物的统计计数)；开放可读框架分析等。常见的编码区统计特性分析工具将多种统计分析技术组合起来，给出对编码区的综合判别。著名的程序有GRAIL和GenMark等，GRAIL提供了基于Web的服务。
6.1.4 启动子分析
启动子是基因表达所必需的重要序列信号，识别出启动子对于基因辨识十分重要。有一些程序根据实验获得的转录因子结合特性来描述启动子的序列特征，并依次作为启动子预测的依据，但实际的效果并不十分理想，遗漏和假阳性都比较严重。总的来说，启动子仍是值得继续研究探索的难题。
6.1.5 内含子/外显子剪接位点
剪接位点一般具有较明显的序列特征，但是要注意可变剪接的问题。由于可变剪接在数据库里的注释非常不完整，因此很难评估剪接位点识别程序预测剪接位点的敏感性和精度。如果把剪接位点和两侧的编码特性结合起来分析则有助于提供剪接位点的识别效果。
6.1.6 翻译起始位点
对于真核生物，如果已知转录起始点，并且没有内含子打断5'非翻译区的话，“Kozak规则”可以在大多数情况下定位起始密码子。原核生物一般没有剪接过程，但在开放阅读框中找正确的起始密码子仍很困难。这时由于多顺反操纵子的存在，启动子定位不象在真核生物中起关键作用。对于原核生物，关键是核糖体结合点的定位，可以由多个程序提供解决方案。
6.1.7 翻译终止信号
PolyA和翻译终止信号不象起始信号那么重要，但也可以辅助划分基因的范围。
6.2 其它综合基因预测工具 除了上面提到的程序之外，还有许多用于基因预测的工具，它们大多把各个方面的分析综合起来，对基因进行整体的分析和预测。多种信息的综合分析有助于提高预测的可靠性，但也有一些局限：物种适用范围的局限；对多基因或部分基因，有的预测出的基因结构不可靠；预测的精度对许多新发现基因比较低；对序列中的错误很敏感；对可变剪接、重叠基因和启动子等复杂基因语法效果不佳。相对不错的工具有GENSCAN和GeneFinding，可以通过Web页面或Email获得服务。
这些程序的主要局限性在于：（1）复合的算法目前只适用少数物种；（2）所有的程序（除了GENSCAN）在输入序列中包含多基因或者部分基因时，所预测的外显子仍可靠，但所预测的基因结构就不一定了；（3）由于尚不完全清楚的原因，预测精度可能比原先想象的低得多，尤其是对新发现的基因。（Burset和Guigó，1996，用百来个简单实例来标定了能得到的程序，结果无一能正确预测出多于一半的外显子）；（4）大多复合算法都明显对测序错误十分敏感（Burset和Guigó，1996）；以及（5）交替剪接、重叠基因和启动子结构这样的基因语法结构仍超出当前程序的处理能力。
既然这些程序中没有一个十全十美，它们都覆盖了一些不同算法，都在迅速进步，因此强烈建议分析每个序列时采用3到4个不同程序，并仔细对比其结果。如果某个工具会经常用到，就值得用大量已知结果的序列对其进行测试，以便对算法适用性有所了解。
第六章 基因预测和基因结构分析
