实验二 萌发麦苗中淀粉酶活力的测定及
水溶性蛋白的Folin-酚法测定
杨明轩 1102040128 （同组成员：黄文君）
一、研究背景及目的
1.1 研究背景
生命活动依赖于一系列有序的生理生化反应，而这些生化反应的高效有序进行离不开生物体内具有催化作用的生物大分子——酶。在20世纪上半叶，酶的发现成为生物化学领域的三大发现之一。对酶进行深入研究不仅有利于揭示细胞新陈代谢的奥秘，而且有许多实际应用价值。酶学理论和酶制品广泛应用于疾病诊断、作物育种、药物设计、食品加工、工业发酵、纺织印染等领域。因而，对酶的研究一直是分子生物学的重要内容，而其中对于酶活力的测定便是对酶研究中非常重要的一项。
在农业生产领域，小麦种子含有大量的淀粉，其淀粉的许多特性优于玉米淀粉。而小麦中又含有许多酶，这些酶在小麦发芽时酶活力都有很大改变，与种子的萌发情况息息相关。在小麦萌发过程中，小麦种子中含有的?-型和?-型两种淀粉酶起到了非常重要的作用。?-淀粉酶能够水解种子中的?-1,4，-葡萄糖苷键，是种子萌发过程中形成的，它可使淀粉糊的粘度迅速下降，起“液化”的作用。?-淀粉酶是一种外切酶，作用于淀粉时，能够从淀粉分子非还原性末端切开?-1,4-糖苷键，水解时沿着淀粉链每次水解掉两个葡萄糖单位，生成麦芽糖。基于两种酶现有的作用位点和机制，我们认为它们处于协同作用的相互关系，本实验以期设计实验测定?和?两型淀粉酶以及总酶的酶活性，验证它们之间是否存在协同作用，同时判断用该方法得出?—淀粉酶活性是否合理，以为今后测定酶活的方法选择提供理论依据。基于此背景，本实验计划探究测定小麦萌发幼苗淀粉酶酶活的方法。
同时，本实验还设计了通过Folin-酚法对萌发麦苗种子水溶性总蛋白进行测定。小麦中提取出来的蛋白、小麦蛋白和胶原蛋白为面粉中的蛋白质的主要成分。小麦籽粒蛋白质含量及其组成,对食品加工品质和营养品质具有决定性作用。
1.2 研究目的
本实验通过采用小麦萌发幼苗为原料，设计实验测定淀粉酶的酶活力。通过以淀粉酶为对象，在对酶活实验的具体设计细节的讨论和分析上，明确同种生物不同种的酶活测定方法上的不同，学习测定酶活力的常规测定方法。同时在实验一蛋白质含量测定方法的研究中，对folin_酚法测定蛋白质含量的技术已经掌握的基础上，本次实验通过对萌发麦苗种子水溶性总蛋白的测定，意在完成对?-淀粉酶和（?- + ?-）总酶比活的计算
二、实验原理
2.1 酶活力测定
我们将酶催化某一反应的能力用酶活力来表示，这是酶的重要指标。本实验根据酶活力测定的三个基本原则—测定值为反应初速度；底物量远超过酶量；在最适宜条件下测定—对萌发小麦种子进行淀粉酶活性的测定，具体为在最适宜淀粉酶发挥作用的条件下，测定淀粉酶催化淀粉水解的产物麦芽糖的产生速率，来表示淀粉酶的催化能力。
根据酶活测定基本原则可知，测酶活力要测定酶促反应速度，酶反应速度越大，酶活力越高。因为产物的量、酶的失活等都会影响酶促反应后期的速度，而每个时期酶的作用机制是一样的，所以使底物量大于酶量，使酶促反应一直处于零级阶段，则酶促反应速度只与酶量有关。测定初速度，即可准确得出酶的催化活力。然而实际上酶促反应初速度非常难以获得，但鉴于最初数分钟反应时间内底物浓度一般小于5%，此时产物生成量几乎与时间成正比，可认为是酶促反应初速度。因此本实验中以5min为反应时间测定该时间范围内淀粉酶催化生成还原糖的量。从酶活表示标准上来说，酶促反应速度可用单位时间内、单位体积中底物的减少量或产物的增加量来表示。在实际酶活力测定中一般测定产物的增加量。在本实验中，用单位时间单位重量小麦萌发幼苗中麦芽糖生成的量来表示酶活力，规定酶活力单位为：每分钟每克鲜重麦种所催化生成的麦芽糖毫克数（毫克麦芽糖·克-1鲜重·分钟-1）。
α-淀粉酶和β-淀粉酶同时存在于萌发小麦幼苗中。β-淀粉酶不耐热，在75℃下易钝化，而α-淀粉酶不耐酸，在pH=3.6以下发生钝化。根据它们的这种特性，在测定时钝化其中之一，就可测出另一个的活力。本实验加热骤冷钝化β-淀粉酶的前提下测出α-淀粉酶的活力，再用非钝化条件下测定的酶总活力得出β-淀粉酶的酶活力。
本实验测酶活以产物的生成量表示，利用淀粉水解产物具有还原性，可以用3,5-二硝基水杨酸法测定，生成在520nm波长下有最大吸收峰的棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸。该物质的颜色深浅与水解产物的还原性在一定范围内符合朗伯比尔定律。基于此规律，用已知浓度的麦芽糖与3,5-二硝基水杨酸充分反应后制作标准曲线，用比色法确定小麦幼苗材料生成的麦芽糖的量，以单位时间单位重量小麦萌发幼苗中麦芽糖生成的量来表示酶活力。该物质的颜色深浅与水解产物的还原性在一定范围内符合朗伯比尔定律。基于此规律，用已知浓度的麦芽糖与3,5-二硝基水杨酸充分反应后制作标准曲线，用比色法确定小麦幼苗材料生成的麦芽糖的量，以单位时间单位重量小麦萌发幼苗中麦芽糖生成的量来表示酶活力。
2.2 Folin-酚法测定蛋白质含量
而对于Folin-酚法测定萌发麦苗水溶性总蛋白含量实验，通过实验一可知Folin-酚法是一种灵敏度极高，可快速简便测定蛋白质含量的方法，其已广泛应用与水溶性蛋白质的测定。该方法根据蛋白质含羟基的氨基酸侧链基团与Folin-酚试剂形成蓝色络合物，其颜色深浅与含羟基氨基酸含量成正比，而含羟基氨基酸含量与蛋白质含量成正比。故可在650nm波长下测量消光值，用于蛋白质含量测定。
2.3 比色法
比色法是物质分析中常用的一种方法。简单地说，这种方法以生成有色化合物的显色反应为基础，是一种通过比较或测量有色物质溶液颜色深度来确定待测组分含量的方法。比色法以朗伯-比尔定律为基础即：
A=εbc，
（A为吸光度，c为待测物质浓度）
依据溶液的光吸收值与其浓度成正比，来确定溶液浓度。这种方法的优点是简单快速，并对样品基本没有消耗。比色分析对显色反应的基本要求是：反应应具有较高的灵敏度和选择性，反应生成的有色化合物的组成恒定且较稳定，它和显色剂的颜色差别较大。选择适当的显色反应和控制好适宜的反应条件，是比色分析的关键。
三、仪器与试剂
3.1实验设备：电热恒温水浴锅（天津市中环实验电炉有限公司） DK-S24型电热恒温水浴锅（上海精宏实验设备有限公司） TDL-40B离心机(上海安亭科学仪器厂)
722分光光度计（上海分析仪器总厂） 架盘药物天平（常熟市双杰仪器总厂） 移液器（大龙）
3.1实验器皿：离心管、研钵、容量瓶（50mL×1,100mL×1）、具塞试管及大白管若干 3.3实验试剂：（1）1%淀粉溶液：称取1g可溶性淀粉，加入80ml蒸馏水，在电磁炉上加热溶解，待冷却后定容至100ml。放在40度水浴锅中待用。
（2）pH 5.6的柠檬缓冲液：
A液—称取柠檬酸20.01g，溶解后定容至1L； B液—称取柠檬酸29.41g，溶解后定容至1L；
取A液5.5ml、B液14.5ml混匀，即为pH=5.5的柠檬酸缓冲液
（3）3,5-二硝基水杨酸溶液：称取3,5-二硝基水杨酸1.00g，溶于20ml1M氢氧化钠溶液中，加入50ml蒸馏水，再加入30g酒石酸钾钠，待溶解后用蒸馏水稀释至100ml盖紧瓶塞以防二氧化碳进入。
（4）麦芽糖标准液（1mg/ml）：称取0.100g麦芽糖，溶于少量蒸馏水中，移入100ml容量瓶中定容至100ml。
（5）0.4M NaOH
（6）250ug/ml标准牛血清蛋白溶液、试剂甲、试剂乙 （7）蒸馏水
3.4实验材料：2g小麦种子（芽长1cm以上）
四、实验步骤
4.1 萌发麦苗淀粉酶活力测定 4.1.1酶液的制备： 称取2g萌发小麦种子，加石英砂、蒸馏水研磨成匀浆，转移至50ml容量瓶中约40ml，室温浸提15-20min，定容到刻度混匀，将浊液倒入离心管内，3500rad/min离心15min，取上清液备用。
4.1.2 α-淀粉酶活性、α-淀粉酶和β-淀粉酶总活性测定： 4.1.2.1 α-淀粉酶、α-淀粉酶和β-淀粉酶总酶制备： 分别取4只具塞试管（2只对照，2只测定），一共8只，按下表加入试剂，进行相关操作。
α-淀粉酶活性测定 对照管 1 2 各酶提取液1ml 70℃恒温水浴15min, 取出立即冰浴冷却 各加1ml pH=5.6柠檬酸缓冲液 40℃（±0.5℃）恒温水浴保温15min 各加NaOH 4ml 0.4M α-及β-淀粉酶活性测定 测定管 3 4 对照管 5 6 测定管 7 8 各管加1ml稀释后酶液（5ml稀释至100ml） 各加NaOH 4ml 0.4M 各加40℃预热的淀粉液2ml 40℃准确保温5min 各加4ml 0.4M NaOH，摇匀 各加4ml 0.4M NaOH，摇匀 取各管中溶液1ml，分别放入15ml具塞刻度试管
4.1.2.2标准曲线的制作及α-淀粉酶、α-淀粉酶和β-淀粉酶总酶测定：
取7个15ml具塞刻度试管编号为9-15，并取4.1.2.1已制备好的α-淀粉酶、α-淀粉酶和β-淀粉酶总酶样液（编号为1-8）同时同步按下表加入相应试剂，进行相关操作。 1 2 3 4 5 6 7 8-15 管号 麦芽糖标准液 蒸馏水（ml） 0.0 1.0 0.1 0.9 0.3 0.7 0.5 0.5 0.7 0.3 0.9 0.1 1.0 0.0 加入1ml 3,5-二硝基水杨酸，混匀 沸水浴5min,冷却，稀释至15ml,混匀 分光光度计OD520下比色，记录消光值值，根据标准曲线计算 4.2小麦水溶性蛋白含量测定 4.2.1样品制备：
取4.1.1制备的蛋白提取液即为本实验蛋白样液。 4.2.2样品液浓度粗测：
取7组具塞试管，分别依照如下列表对样品蛋白液进行稀释并测定其OD650 1 2 3 4 5 6 管号 1 2 4 5 10 稀释倍数 空白组 样品液(ml) 蒸馏水(ml) 试剂甲 试剂乙 0 1 1 0 0.5 0.5 0.25 0.75 0.2 0.8 0.1 0.9 7 20 0.05 0.95 各5ml，混匀，室温10mim 各0.5ml，立即混匀，室温30mim，2h之内稳定 根据OD值确定样液合适的稀释倍数（大致应为0.2-0.8之间）
4.2.3标准溶液浓度的确定及测定
将1mg/mlBSA原液1ml稀释成250μg/ml，取6组具塞试管依次按照下表配制不同浓度梯度的BSA标准蛋白使用液。同时根据4.2.2中确定的样品稀释浓度，配制3管最佳稀释浓度的样液，同时向标准蛋白使用液及样液中加入试剂甲各5ml后混匀，室温10mim ，再加入试剂乙各0.5ml，立即混匀，室温30mim，于722分光光度计测量OD650。绘制标准曲线。
管号 250μg/ml BSA原液（ml） 蒸馏水(ml) 试剂甲 试剂乙 1 0 1.0 2 0.2 0.8 3 0.4 0.6 4 0.6 0.4 5 0.8 0.2 6 1.0 0 7 8 9 样品稀释液各1ml 各5ml，混匀，室温10mim 各0.5ml，立即混匀，室温30mim，2h之内稳定 五、数据记录
5.1萌发麦苗淀粉酶活力测定 5.1.1 麦芽糖标准曲线数据 1 2 3 管号 OD520
4 0.307 5 0.438 6 0.572 7 0.650 0.000 0.031 0.170
表1 麦芽糖标准曲线数据表
5.1.2 α-淀粉酶、α-淀粉酶和β-淀粉酶总酶数据 管号 α-淀粉酶活性测定 对照管 8 OD520 0.396 9 0.406 测定管 10 0.592 11 0.584 α-及β-淀粉酶活性测定 对照管 12 0.163 13 0.157 测定管 14 0.299 15 0.300 表2 酶活测定数据表
5.2小麦水溶性蛋白含量测定 5.2.1样液稀释浓度预实验 1 2 管号 1 稀释倍数 空白组 OD650 0.000 1.411 3 2 0.806 4 4 0.465 5 5 0.395 6 10 0.210 7 20 0.119 表3 样液稀释平行测定数据表（预实验）
如上表数据，本次实验所用样液为第4管即将原蛋白母液稀释4倍后的样液使用液。 5.2.1 BSA标准曲线及最佳样液使用液数据 管号 OD650 1 0.000 2 0.122 3 0.289 4 0.380 5 0.472 6 0.569 7 0.455 8 0.462 9 0.463 表4 BSA标准液数据表
六、结果计算
6.1对萌发麦苗淀粉酶活力的测定
麦芽糖溶液标准曲线0.70.60.5y = 0.6336xR2 = 0.9953OD5200.40.30.20.1000.20.40.60.811.2麦芽糖溶液浓度（mg/ml）OD520线性(OD520) 由标准曲线可见，显著性R2=0.9953，线性拟合程度较好，麦芽糖溶液吸光值与其浓度基本呈正比例关系。 类别 α-淀粉酶活性测定 对照管 8 9 OD520
α-及β-淀粉酶活性测定 对照管 12 13 0.163 0.157 测定管 14 0.299 15 0.300 测定管 10 11 0.592 0.584 0.396 0.406
实验二萌发麦苗水溶性蛋白含量测定预习报告 (3)汇总
