山豆根四倍体优良株系的综合评价

南方农业学报JournalofSouthernAgriculture2019，50（11）：2401-240911期2095-1191；ISSNCODENNNXAABhttp://www.nfnyxb.com·2401·DOI：10.3969/j.issn.2095-1191.2019.11.04山豆根四倍体优良株系的综合评价

2

邓传华1，，梁

莹3，李林轩3，蔡锦源4，梁颖5，杨振德2，韦坤华3*

530001）

（1广西林业勘测设计院，南宁

实验室，南宁

530011；2广西大学林学院，南宁530004；3广西药用植物园/广西药用资源保护与遗传改良重点545616；5广西中医药大学附属瑞康医院，南宁

530023；4广西科技大学鹿山学院，广西柳州

摘要：【目的】分析山豆根四倍体株系与二倍体株系间的生长发育及其有效成分差异，为山豆根优良种质的选育提供理论依据。【方法】以10个四倍体株系和1个二倍体株系的3年生山豆根为材料，分别从农艺性状（株高、茎粗、叶面积和根干重等）、生理生化［可溶性糖、可溶性蛋白、丙二醛（MDA）含量及超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化物酶（POD）活性］、内源激素［脱落酸（ABA）、油菜素（BR）、赤霉素（GA）、茉莉酸甲酯（JA-ME）和玉米素（Z）］、苦参碱和氧化苦参碱含量等多角度检测及评价其生长与品质状态，并进行因子分析，综合评价出高产优质的山豆根株系。【结果】在山豆根四倍体株系中，A-66株系长势最好，其株高（208.60cm）和根干重（138.59g）均显著大于其他株系（P<0.05，下同）；苦参碱含量最高的是A-96株系（0.6639mg/gDW），氧化苦参碱及其与苦参碱总含量最高的是D-37株系（30.6366和31.1986mg/gDW）。山豆根四倍体药用有效成分中的苦参碱含量与其株高和茎粗呈正相关，而氧化苦参碱含量与其株高和茎粗呈负相关。根据因子分析结果可知，综合评分最高的为A-66株系（99.13分），其次是C-16（89.99分）、B-309（84.65分）和A-96株系（80.90分），其余株系的综合评分均未达80.00分，二倍体株系的综合评分最低（53.71分）。【结论】山豆根四倍体株系A-66、C-16、B-309和A-96的综合得分均高于80.00分，即其品质较优，可作为优良品种选育对象进行深入研究。

关键词：山豆根；四倍体；农艺性状；生理指标；有效成分中图分类号：S567.19

文献标志码：A

文章编号：2095-1191（2019）11-2401-09

ComprehensiveevaluationoftetraploidstrainsofSophora

tonkinensisGagnep.

2

DENGChuan-hua1，，LIANGYing3，LILin-xuan3，CAIJin-yuan4，

LIANGYing5，YANGZhen-de2，WEIKun-hua3*

2

（1GuangxiForestInventoryandPlanningInstitute，Nanning530011，China；ForestryCollege，GuangxiUniversity，

3

Nanning530004，China；GuangxiKeyLaboratoryofMedicinalResourcesProtectionandGeneticImprovement，

4

GuangxiBotanicalGardenofMedicinalPlant，Nanning530023，China；LushanCollegeofGuangxiUniversityof

5

ScienceandTechnology，Liuzhou，Guangxi545616，China；RuikangHospitalAffiliatedtoGuangxiUniversityof

TraditionalChineseMedicine，Nanning530001，China）

Abstract：【Objective】Thedifferencesofgrowth，developmentandactivecomponentsbetweentetraploidanddiploid

strainsofSophoratonkinensisGagnep.wereanalyzed.Itprovidedatheoreticalbasisfortheselectionofexcellentgerm-plasmofS.tonkinensis.【Method】Tentetraploidstrainsandonediploidstrainofthree-year-oldS.tonkinensiswereusedasmaterials.Theagronomictraits（plantheight，stemdiameter，leafareaandrootdryweight，etc.），physiologicalandbio-chemicalcharacteristics［solublesugar，solubleprotein，malondialdehyde（MDA）content，superoxidedismutase（SOD）andperoxidase（POD）activity］，endogenoushormones［abscisicacid（ABA），brassinolide（BR），gibberellin（GA），methyljasmonate（JA-ME）andZeatin（Z）］，matrineandoxymatrinecontentswereusedtodetectandevaluatetheirgrowthandquality.Then，thefactoranalysiswascarriedouttocomprehensivelyevaluatethehigh-yieldandhigh-qualitystrainsofS.tonkinensis.【Result】TheA-66strainhadthebestgrowth，anditsplantheight（208.60cm）androotdryweight（138.59g）weresignificantlyhigherthanotherstrains（P<0.05，thesamebelow）.ThehighestcontentofmatrinewasfoundinA-96strain（0.6639mg/gDW），andthestrainwiththehighestcontentofoxymatrineandthetotalcontentofoxymatrineandmatrinewasD-37strain（30.6366and31.1986mg/gDWrespectively）.Thecontentofmatrinewasposi-收稿日期：2019-05-12基金项目：国家自然科学基金项目（81473309，81460582）；国家中药材产业技术体系建设项目（CARS-21）；广西科学研究与技术

开发计划项目（桂科AD17129044）

作者简介：*为通讯作者，韦坤华（1983-），博士，研究员，主要从事药用植物生物技术研究工作，E-mail：divinekh@163.com。邓传华

（1983-），主要从事森林培育研究工作，E-mail：dengchuanhua-lin@163.com

·2402·南方农业学报50卷tivelycorrelatedwithplantheightandstemdiameter，whilethecontentofoxymatrinewasnegativelycorrelatedwithplantheightandstemdiameter.Accordingtothefactoranalysis:thehighestcomprehensivescorewasa-66（99.13），followedbyC-16（89.99），B-309（84.65）andA-96（80.90）.Theotherswerenotupto80.00，andthelowestwasdiploid（53.71）.【Conclusion】ThecomprehensivescoresoftetraploidstrainsA-66，C-16，B-309andA-96ofS.tonkinensisarehigherthan80.00points，whichindicatethatthetetra-ploidstrainsofS.tonkinensisaresuperiorinqualityandcanbeusedasthebreedingobjectsoffinevarietiesforfurtherresearch.

Keywords：SophoratonkinensisGagnep.；tetraploid；agronomictraits；physiologicalindex；activecomponents

0引言

【研究意义】山豆根为豆科植物越南槐（SophoratonkinensisGagnep.）的干燥根和根茎，味苦，性寒，具有清热解毒和消肿利咽的功效（国家药典委员会，2015），临床上常用于治疗咽喉肿痛（聂安政等，2018）。近年来，由于山豆根药材市场需求量的增长而导致盲目采挖，加之山豆根分布区域较窄，对生长环境要求较苛刻，致使其野生资源锐减（檀龙颜和马洪娜，2017）。为解决这一供需矛盾，已有学者采用人工栽培方式以扩大药源，但在人工栽培中发现山豆根在开花结荚期存在严重的病虫害问题，且种子成熟时易自然脱落，甚至出现种子种性退化等现象，导致栽培的山豆根药材产量低、品质差（林杨，2014；檀龙颜和马洪娜，2017）。为拓宽山豆根种质资源，培育高产优质的山豆根新品种，本课题组通过秋水仙素成功诱导获得山豆根四倍体（Weietal.，2018）。在此基础上进行山豆根四倍体株系的产量及品质评价，可为筛选出品质优、产量高的山豆根四倍体新品种提供重要依据。【前人研究进展】至今，已有大量学者利用组织培养技术对山豆根进行相关研究（李林轩等，2012；Weietal.，2013；檀龙颜和马洪娜，2017），成功培育出一大批试管苗，并进行大面积的大田推广栽培，但在山豆根继代过程中常出现分化能力和生长能力下降等问题（刘波等，2015），因此筛选出优质山豆根品种，建立稳定的快繁体系，提高人工栽培山豆根产量已迫在眉睫。已有研究表明，多倍化或全基因组加倍驱动植物进化与环境适应性，多倍体植物与二倍体祖先种相比具有更强的逆境胁迫抵御能力（白英豪等，2018），如四倍体拟南芥、四倍体柑橘和六倍体小麦的耐盐性均明显强于对应的二倍体植株，与二倍体相比，多倍体植物能在环境胁迫下较好地维持组织和细胞内的钾钠平衡（Liuetal.，2018）。汪珍春等（2012）通过对比人工栽培一年生何首乌同源四倍体在块根产量和品质方面的差异，发现何首乌多倍体块根重显著提高，其有效成分二苯乙烯苷产量显著高于二倍体株系。鉴于药用植物的特殊性，无论何种用途，对其成分稳定性的要求均较粮食和香料等植物高，药用植物的倍性变化通

常导致其次生代谢产物含量的变化。药材活性成分含量是评价药材质量的重要标准之一（段英姿和客绍英，2015），因此需要通过适当地检测筛选以获得药用成分量增加的个体并培育成为新的品种（何韩军等，2010）。迄今为止，人工诱导多倍体在植物特别是药用植物育种方面已得到广泛应用，并取得一

定进展，在决明（丁如贤等，2007）、三七（王朝梁等，2007）、黄芪（张利珍和李前忠，2010）、何首乌（黄和平等，2013）、柴胡（庄云等，2013）、白术（易思荣等，2014）、桔梗（韩盼盼等，2015）和太子参（何绿洪等，2017）等药用植物上均进行了多倍化尝试。【本研究切入点】至今，关于山豆根优良品种培育方面的研究在国内外鲜见报道，虽然本课题组攻克了山豆根四倍体人工诱导技术，并获得四倍体植株，但针对人工选育后山豆根四倍体生长及其有效成分的研究鲜见报道。【拟解决的关键问题】以11个山豆根组培快繁的三年生不同株系为试验材料，分别从农艺性状、生理生化、内源激素、苦参碱和氧化苦参碱含量等多角度检测及评价其生长与品质状态，比较不同株系山豆根间的差异，为山豆根优良种质的选育提供理论依据。

1材料与方法

1.1

试验材料

选取11个不同株系三年生山豆根材料（组培苗由广西药用植物园离体库生产及驯化，一年后移栽至广西药用植物园试验田），分别编号为2n（CK）、A-2、A-58、A-66、A-96、B-309、B-76、B-98、C-16、D-37和D-103，其中2n（CK）为二倍体株系，是生产上常用的株系，其余株系均为对二倍体植株进行人工诱导获得的四倍体株系。山豆根药材采收前每个株系随机选取5株植株（避开边缘），采集叶片为主茎上从上往下第3层复叶的第3对叶片，每个株系共采集15片叶子，放入装有冰袋的泡沫箱中，低温带回实验室，将采集到的各株系不同植株叶片混合并剪碎，用于生理生化和内源激素指标测定；采集山豆根的根部洗净、烘干至恒重，用于有效成分测定。

聚乙烯吡咯烷酮、磷酸、愈创木酚、牛血清蛋白标准液和ELISA激素试剂盒购自上海酶联生物科技

11期邓传华等：山豆根四倍体优良株系的综合评价

·2403·有限公司，苦参碱标准品（Solarbio，批号M813523）和氧化苦参碱标准品（Solarbio，批号A111285）购自天津万象恒源科技有限公司，30%过氧化氢、2,4-二硝基苯肼、蒽酮、2-酮戊二酸、DL-天冬酸、氢氧化钠、丙酮酸标准液、三氯乙酸、95%乙醇、硫代巴比妥酸、葡萄糖标准液、硫酸和考马斯亮蓝染液G-250均为市售分析纯试剂。主要仪器设备：752N紫外分光光度计（上海仪电分析仪器有限公司）、Agilent1260In-finity液相色谱仪、FA2004型电子天平（上海舜宇恒平科技仪器有限公司）、移液枪（Eppendorf公司）、HR/T20M台式高速冷冻离心机（湖南赫西仪器装备有限公司）、INFINITE200PRO酶标仪（TecanAu-striaGmbhUntersbergstr）、HH-S数显二孔恒温水浴锅（金坛市医疗仪器厂）等。1.2试验方法

1.2.1农艺性状测量株高：为植株主茎最大高度。茎粗：用游标卡尺测定植株离地面1~2cm处的茎基部直径。叶面积：小叶长×小叶宽（用游标卡尺测量主茎从上往下第3层复叶的第3对叶片的长度和宽度）。复叶：测量顶芽下第3层复叶，用直尺测量复叶基部到顶叶的总长及最长一对小叶。根干重：取回山豆根后用自来水仔细清洗，吸水纸吸干后，烘箱65℃烘至恒重，称重。

1.2.2主要生理生化特性测定参考邹琦（2000）的方法，可溶性糖含量采用蒽酮比色法测定，可溶性蛋白含量采用考马斯亮蓝比色法测定，丙二醛（MDA）含量采用硫代巴比妥酸（TBA）反应法测定；参考李合生（2000）的方法，超氧化物歧化酶（SOD）活性采用氮蓝四唑（NBT）比色法测定，过氧化物酶（POD）活性采用愈创木酚比色法测定。以上各项指标均采用鲜样进行测定，每处理3次重复。

1.2.3内源激素含量测定脱落酸（ABA）、油菜

素（BR）、赤霉素（GA）、茉莉酸甲酯（JA-ME）和玉米素（Z）含量均按ELISA试剂盒使用说明进行测定，试剂盒使用时需在弱光下进行操作。

1.2.4有效成分含量测定山豆根有效成分苦参碱和氧化苦参碱含量参考《中华人民共和国药典》（2015版）中的方法进行测定。1.3统计分析

采用Excel2010进行试验数据整理，以SPSS17.0进行统计分析，包括单因素方差分析（One-wayANOVA）和Duncan?s多重比较。

2结果与分析

2.1

不同株系山豆根农艺性状差异比较

由表1可知，不同四倍体株系与二倍体株系相比，A-58、A-66、A-96、B-309和C-16株系的株高显著高于二倍体株系（P<0.05，下同），A-96、B-309和C-16株系的茎粗显著大于二倍体株系，A-66、C-16和D-37株系的根干重显著高于二倍体株系；大部分四倍体株系的叶片厚度、叶面积、小叶长、小叶宽、复叶长及复叶宽与二倍体株系差异不显著（P>0.05，下同），尤其是不同株系间的小叶宽和复叶宽均无显著差异。在不同四倍体株系中，以A-66株系的株高最高（208.60cm），是二倍体株系（125.80cm）的1.66倍，其根干重（138.59g）是二倍体株系（75.45g）的1.84倍，同时显著大于其他四倍体株系；B-309株系的茎粗最粗（12.37mm），是二倍体株系（8.83mm）的1.40倍；B-76和D-37株系的叶片厚度明显偏薄，D-37株系的叶面积最小（5.42cm2）。2.2

不同株系山豆根生理生化特性比较

由表2可知，相对于二倍体株系，不同四倍体株

表1三年生不同株系山豆根农艺性状差异比较

Table1Analysisofagronomictraitsindifferentstrainsofthree-year-oldS.tonkinensis

株系Strain

株高（cm）Plantheight

2n（CK）125.80±21.40cA-02134.60±17.34cA-58183.20±63.02abA-66208.60±37.48aA-96198.60±44.67aB-309186.00±54.25abB-76119.00±17.58cB-98146.40±32.56bcC-16192.80±30.35aD-37126.40±15.58cD-103134.2±21.89c

茎粗（mm）叶片厚度（mm）叶面积

StemVane（cm2）diameterthicknessLeafarea8.83±0.90cde0.44±0.03bc7.27±1.34ab10.26±1.46abcd0.41±0.01c6.18±1.95abc9.58±1.03bcd0.43±0.02bc6.54±1.09abc10.78±0.88abc0.47±0.01a5.64±0.65bc11.38±1.66ab0.41±0.03c7.50±0.44a12.37±2.42a0.43±0.02bc7.10±1.71abc7.05±1.23e0.34±0.01e5.92±1.88abc10.03±1.39bcd0.44±0.03ab6.56±1.68abc12.18±1.97a0.45±0.01ab5.53±1.27bc10.74±2.11abc0.38±0.02d5.42±1.51c8.44±1.27de0.45±0.02ab6.33±0.80abc

小叶长（mm）

Leafletlength42.37±2.69ab39.45±4.90abcd39.53±4.79abcd37.05±4.59bcd43.39±1.39a41.90±3.81abc38.35±5.84abcd38.82±4.89abcd36.90±4.73cd36.44±3.25d38.70±3.91abcd

小叶宽（mm）复叶长（cm）复叶宽（cm）根干重（g）LeafletCompoundCompoundRootdrywidthleaflengthleafwidthweight17.05±2.1314.38±1.59c9.10±0.9175.45±0.44c15.39±2.9814.24±1.92c8.44±1.0380.20±10.70c16.47±1.1214.78±1.12bc8.46±0.4880.33±10.26c15.24±0.7413.66±1.27c7.90±1.45138.59±1.82a17.29±0.5416.54±2.36ab9.38±0.5148.88±3.27d16.80±2.5917.08±0.99a9.08±0.7869.08±1.85cd15.15±2.9913.76±1.76c7.94±1.4150.85±9.83d16.74±2.5114.76±1.23bc8.52±0.8676.58±1.34c14.86±1.4914.32±1.51c9.30±3.14115.58±3.87b14.72±2.7813.86±1.66c8.02±0.93109.89±9.02b16.32±0.5414.32±1.68c8.24±0.7949.89±2.53d

同列数据后不同小写字母表示差异显著（P<0.05）。表2和表3同

Differentlowercaselettersinthesamecolumnrepresentedsignificantdifference（P<0.05）.ThesamewasappliedinTable2andTable3