采用VP箱时,薄层板是水平放置的,展开室横割成许多小槽,槽中分别注入各种溶剂,展开时将薄层面对这些小槽,薄层既不能接触槽壁以免斑点扩散,又不能距离槽壁过大而减弱溶剂蒸气的作用。每一小槽中的蒸气仅对其所面对的薄层产生影响,这样就能按设计的要求,在薄层上造成蒸气程序,此蒸气程序可使欲分离的物质斑点在某薄层区域加速前进,而在另一区域减速展开。VP-箱的出现使一些不能互溶的溶剂也能组成一个溶剂系统而在展开过程中对分离发挥作用。例如在分离靛酚、苏丹红、甲基黄及4-硝基苯胺混合物时用苯为展开剂,4种染料的Rf值较低并且不能完全分离,见图7-3-36A。
改用苯-氯仿(8:2)为展开剂,Rf值增高,但分离不能改善,见图7-3-36B。然而当用以苯为展开剂的VP-箱和有一简单的苯-氯仿蒸气梯度时,可以大大改善分离,见图7-3-36C,D,而且能够在VP-箱中按照需要使板面上的任一部位以任何速度对斑点的移动作加速或减速,从而控制色谱分离过程。不论所研究物质的极性如何,也不论溶剂及所用蒸气组成的极性如何,都能设法获得高度改善的分离,因此有利于同系物、异构体和基本结构相同的各种衍生物的分离。这种技术对药物化学和毒理学中的许多衍生物的分离极为有用。例如激素类、磺胺类、安眠药类、生物碱类、农药、止痛药、镇痛药、麻醉药及精神病药以及对毒理学和生物化学的极为重要的代谢产物的分析。其次,程序蒸气薄层在制备色谱中也十分有用,在常规制备薄层中经常因物质点样过多而发生相互重叠,用本技术能使区带完全分开。
(七)分离-反应-分离展开(SRS法)
Stahl介绍的分离-反应-分离展开,也是一种双向展开技术,与一般双向展开法不同的是在两个方向展开时使用同一种展开剂,将样品点在正方形薄层板一角,展开一次后将薄层板用加热、光照或用酸、碱蒸气等方法处理后,将薄层板转90°,于垂直于第一次展开的方向用相同展开剂再展开第二次,显色后凡在对角线上的成分都是性质稳定的成分,而不在对角线上的成分是经处理后新产生的成分,因此SRS法也可称为反应薄层法,Stahl首先用此技术成功地研究了除虫菊酯的失活性。用己烷-乙酸乙酯(75:25)进行双向展开,第一向展开后样品经日光或紫外光照射后再加热,薄层上出现了除虫菊酯的氧化产物,见图7-3-37。
(八)超压薄层色谱法(OPLC)
上述的各种薄层展开技术多是由毛细管作用使展开剂通过薄层上的吸附剂进行组分的分离。1979年由Tyihak提出的超压薄层色谱法是应用加压室(PUM室)的平面液相色谱技术。1980-1983年Tyihak等对有关理论及分析条件等的一系列研究,使这一分析技术有了进一步发展,1988年执中对此法进行了全面的介绍。
1.用于超压薄层的仪器
(1)超微型加压室(PUM室)
圆形的PUM室(纵截面),见图7-3-38。吸附层6涂布于玻璃板或塑料板7上,吸附板上面完全盖覆一塑料膜9,由于交界空间部的气体压力使膜与上支架金属板8紧贴,固定于其表面上,并用O形密闭环5封闭,因此,空间作为气体压力缓冲室。气体入口3,压力表1及开剂进口10。安装在上支架金属板上的入口2用于在加压下样品的导入,上下支架金属板的直径分别为230nm及235nm。吸附层面积为10cm×10cm或20cm×20cm不等,上下支架金属板用几个夹子4固定。
(2)超压薄层色谱仪
Chrompres 25超压薄层色谱仪,包括主机和两个泵,溶剂传送泵2,连接展开剂进口阀,可连续供展开剂至加压的薄层表面。水泵1只用两次:在开始前以提高室压力,完全展开后以撤空加压室,图7-3-39为加压室打开时的情况,图中上铸件1和下铸件3用不锈钢榫入锁孔6中使其钩扣在一起。如放开锁扣,可同时对上铸件顶部边上的锁杆施加压力。拉动两个柄5,可将上盖升起或放下。
高效薄层板置于2的位置,由在上铸件的薄膜覆盖的缓冲室4加压。在主机锁定并已加压的情况下,溶剂从展开剂孔7进入展开剂槽8中。
2.分析技术 (1)薄层板的浸渍
要求薄层板的边必须用聚合物液体(惰性塑料分散体、石蜡)封闭以免展开剂从薄层板的边缘溢出。 (2)展开方式
可进行单向、双向及连续展开。 (3)分离技术
用Chrompres 25超压薄层色谱仪将已点样的高效薄层板置于控制温度的高压膜平面加压下由阀系统引入展开剂至薄层板,展开剂的移动可由仪器上的有机玻璃上盖观察,展毕,停止展开剂泵,减去压力,取出薄板。 (4)定量测定
用薄层扫描仪进行测定。
OPLC法分离时间短,展速较一般薄层色谱快5-10倍,分离效率高,斑点集中,灵敏度高,重现性好,可进行一种展开剂展开或多步梯度展开,可进行分析或半制备分离,节约展开剂,各步可离线、离线/在线或完全离线操作。
本法最大的优点是展距与时间呈线性关系,见图7-3-40,分离效率(N值)随展距的加长而提高,见图7-3-41,这两个特点是一般薄层色谱甚至高效薄层色谱所不具备的。例如采用高效薄层板以正丁醇-乙酸-水(4:1:1)为展开剂,展距9.3cm经250min仍不能将21种氨基酸完全分开,并且斑点扩散,但用OPLC技术,膜外压为12atm,,展开剂流速10ml/h,展距16cm,只需47min,上述氨基酸可以得到分离。