激光共聚焦显微技术在共定位应用中的常见问题
王娟娟*, 魏学红
【摘 要】荧光共定位分析是当今生物显微成像中一个极为常见的技术。本文从以下4个方面详细介绍了使用Zeiss LSM880型激光扫描共聚焦显微镜(confocal laser scanning microscope，CLSM)进行共定位研究时常见的问题及解决方法：1.如何用共聚焦进行共定位实验；2.如何进行共定位分析；3.如何评价共定位；4.如何判定共定位结果。在共定位研究中，只要按照共定位实验的基本要求拍摄图像，并按照上述方法进行分析，便可得到准确可靠的共定位分析结果。
【期刊名称】影像科学与光化学 【年(卷),期】2018(036)006 【总页数】7
【关键词】 激光共聚焦显微技术； 共定位； 评价方法 http://www.yxkxyghx.org
2018-02-27收稿, 2018-04-27录用
2016年中央提升王娟娟人才事业启动经费(304545007)项目资助
激光共聚焦显微技术是自80年代发展起来的一项高新研究技术[1-4]，目前其应用已扩展到细胞学、微生物学、发育生物学、遗传学、神经科学、生理和病理学等学科，成为了生物医学成像领域中重要的研究工具[5]。它不仅可用于单色/多色荧光成像、Z轴采集和三维重构、时间序列成像、大视野拼图、荧光强度测量、荧光共定位分析，还可用于光谱扫描/光谱拆分、荧光共振能量转移(FRET)和荧光漂白后恢复实验(FRAP)等[4,6-8]。
荧光共定位分析是对同一空间中两种或更多种不同颜色的荧光标记之间的重叠度进行分析，这是当今生物显微成像中一个极为常见的技术[9-13]。共定位分析主要用于研究2个荧光分子在组织或细胞中是否定位于同一区域或存在相关性。可用于荧光共定位分析的软件有MetaMorph、Imaris、NIS Nikon、ZEN Zeiss、ImageJ/ Fiji等。Zeiss LSM880激光扫描共聚焦显微镜(confocal laser scanning microscope，CLSM)仪器自诞生以来，便在荧光共定位应用中发挥出了其独特的作用。然而大多数科研人员在使用此仪器做共定位研究时，在图像拍摄、图像分析、数据处理中存在一些比较普遍的问题，这会直接影响到共定位结果的可靠性。因此，笔者将其中一些典型问题进行了总结和归纳，希望对做荧光共定位研究的科研工作者有所帮助。
1 共定位实验的基本要求
常见问题：①扫描通道设置中，2个荧光通道的光学切片厚度不一致；②比较荧光共定位效果的各张图片使用不同的拍摄参数；③图像荧光过曝；④图像中共定位效果好，但未用单独标记的对照样品来设定阈值。
荧光共定位分析对图像扫描参数有严格的要求。①首先，避免激发光及发射光串色，保证用于荧光共定位分析的2种荧光信号之间不存在信号串扰的现象，以保证荧光信号的准确性；②其次，扫描通道设置中，需要调节2个荧光通道的Pinhole直径使光学切片厚度一致(图1)，以保证像素点大小一致；③需要比较荧光共定位效果的多张图片，各通道应使用相同的拍摄参数，从而使共定位结果具有可比性[14]；④图像荧光不可过曝；⑤对于能找到单标记区域的图像(图2)，可在“Colocalization”中进行阈值的设定，对于共定位特别好的图像(图3)，必须做单独标记的对照样品来设定阈值；⑥尽量选用高数值孔径的物镜
和高分辨率的显微镜进行拍摄，以获得更准确的结果。
2 共定位分析
常见问题：①在Coloc视图中，未设定单通道荧光的阈值就进行荧光共定位分析；②比较荧光共定位效果的各张图片时使用不同的阈值设定；③对于能找到单标记区域的图像，在“Colocalization”中设定阈值时，选择单通道信号的区域不正确；④未选择感兴趣区域，用整幅图像的荧光共定位效率进行分析。 进行荧光共定位分析时，在多通道荧光图像中，每个像素点都含有至少2种荧光信号的灰度值信息(Ch1，Ch2)。首先需要在共定位软件模块下方选择感兴趣的2种荧光信号[14](图4)。在Horizontal下拉菜单中选择散点图中X轴所代表的荧光信号，例如Ch2-T1；在Vertical下拉菜单中选择Y轴所代表的荧光信号，例如Ch1-T2。此时，散点图以Ch2和Ch1的灰度值分别作为X轴和Y轴的坐标，定义出了像素点在散点图中的位置，即图像中的每个像素点都可以根据自身Ch1和Ch2的灰度值信息，在散点图中找到自己的位置，图像中的像素点与散点图中的点一一对应。
图3的散点图见图5。只含有荧光信号Ch2的像素点，在散点图中靠近X轴，位于区域1中；只含有Ch1的像素点靠近Y轴，位于区域2中；区域3中的点为同时含有 Ch1和Ch2的像素点，而区域4中的点Ch1和Ch2的灰度值都很低，即背景。共定位越高，像素点越集中于斜率等于1的直线附近。通过散点图可以对共定位情况有一个直观的了解[14]。
然后，由于各区域的界限需要人为设置，因此需要定义出图像中哪些像素点只含有单色荧光，以设定散点图中区域1和区域2的范围。
以图2的A549细胞为例，如果图像中有肉眼可识别的只含有Ch1或Ch2信
激光共聚焦显微技术在共定位应用中的常见问题
