Master Mix 10μl，上、下游引物(10μmol/μl)各0.5μl，探针(10μmol/μl)0.2μl，灭菌水6.8μl，结核杆菌阳性DNA样品2μl。反应条件为: 95℃ 15min(×1) ，94℃ 10s→60℃ 20s →72℃ 30s(×40)。按照上述反应体系及反应条件，随着PCR体系在每一个循环结束后测定吸光值，就得到了以循环数为横坐标、吸光值为纵坐标的定量曲线和以标准品浓度的对数值为横坐标，Ct值为纵坐标的标准曲线。
1.7 琼脂糖凝胶电泳，测序
实时PCR产物2％琼脂糖凝胶电泳，电压100V，时间1h。ABI3130基因分析仪序列分析。 1.8 特异性实验
分别用阴性痰标本提取物25份和金黄色葡萄球菌DNA提取物、肺炎链球菌DNA提取物、肺炎克雷伯杆菌DNA提取物共20份为对照模板进行Taq-man探针进行实时PCR检测。 1.9 检测限实验
对阳性样本以10倍梯度进行稀释，共5个稀释度，最大稀释倍数为10万倍，然后以各稀释液为模板进行实时PCR检测。 1.10 重复性实验
对107标准品重复测定4组10倍倍比稀释阳性DNA 五次,分别统计其Ct 值。
1.11 灵敏度实验
对102例痰液标本分别进行抗酸染色显微镜检测和实时PCR检
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测。
2 结果
2.1 定量曲线
各个稀释度标准阳性株在第一个循环结束后测到一个基础吸光值，接下来一直到第20个循环结束时都没有明显变化。从第23个循环开始其中的一个反应的吸光值增大，定量曲线开始抬头，25个循环(Ct 值) 后，曲线迅速上扬，至第36个循环前后达到峰值，随后进入平台期，一直到反应结束。阴性对照未出现扩增曲线（图1）。 2.2 琼脂糖凝胶电泳结果
痰液DNA进行验证实验，对所获取的PCR产物进行测序，序列分析显示该产物为TB核酸序列。 2.3 特异性实验
葡萄球菌等呼吸道易感菌的DNA提取物为对照模板进行Taq-man探针进行实时PCR未检测到无荧光信号。 2.4 检测限实验
对阳性样本以10倍梯度进行稀释，然后以各稀释液为模板进行Taq-man探针进行实时PCR检测，荧光信号随样本浓度下降而下降，线性范围为103～107copies/ml，检测下限为102copies/ml。 2.5 重复性实验
重复测定4组10倍倍比稀释后的标准品，浓度由高到低的Ct 平均值分别是21.07、24.6、28.16、31.57，标准差分别是0.69、0.88、0.39、1.82，变异系数分别是3.9%、4.3% 、1.6%、6.9%，随着标准
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品拷贝数的降低，Ct 值增大，标准差和变异系数也呈逐渐增大的趋势。
2.6 灵敏度实验
对确诊肺结核病人102例痰液标本分别进行直接涂片染色法和实时PCR检测结果对比。直接涂片染色法检测灵敏度为30％。荧光PCR检测灵敏度为100％。 3 讨论
肺结核的实验室快速诊断对出入境人员传染性肺结核的发现有重要的意义，目前，肺结核的实验室诊断方法主要有细菌学检查、免疫学检查和分子生物学检查。
细菌学检查是目前传染性肺结核诊断的金标准，检测出来的阳性对肺结核的诊断的意义最大，主要有痰涂片抗酸染色直接找分枝杆菌和分枝杆菌培养方法。但是，痰涂片抗酸染直接镜检法的阳性率不高，阳性率只有14%～47%，且受痰标本质量的影响，阳性率相差很大［1］。提高痰标本的质量，加强痰涂片镜检的质量控制是目前国内外研究的重点［4］。培养方法的阳性率稍高于涂片法，且能得到活菌，但由于结核分枝杆菌的生长速度太慢，检测的时间长，传统方法培养需要5～8周时间。BACTEC是采用放射性同位素技术对结核菌进行自动检测的仪器，使培养分枝杆菌可以把培养时间大大缩短，需9～14d。分枝杆菌生长指示管（MIGT）使用荧光计量技术检测分枝杆菌的生长，无污染，阳性率高［15,16］，时间短，是快速培养的主流。
实验室检测结核分枝杆菌是临床结核病诊断的主要依据。传统检
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测结核分枝杆菌的主要方法为直接涂片法和培养法［20］，但直接涂片法存在特异性差、灵敏度低和不能鉴别抗酸菌死活的缺点，而培养法则存在特异性差和需时较长的不足［5］，实际临床应用受限。本实验中102例标本实时PCR阳性102例(102%)，而直接涂片法只有30例(30%)。实时PCR法与抗酸染色法比较符合率为100%。实时PCR法操作简便、快速、高效，具有很高的敏感性、特异性，且其在密闭体系中完成扩增并进行实时测定，降低了污染可能性，并可精确地进行定量检测，为传染病监测提供参考。实时PCR技术特别对一些含菌量低的标本(如尿液、胸腹水)的检测具有非常实用的价值，大大提高了结核分枝杆菌的检出率。实时PCR检测原理为TaqMan探针法，是在反应体系中加入一个荧光标记探针，探针的5′端标以荧光发射基团FAM， 3′端标以荧光猝灭基团TAMRA。实时PCR过程中，利用Taq酶的5′→3′外切核酸酶活性释放荧光信号。模板每复制一次，便释放一个荧光信号，根据荧光强弱可对模板进行准确定量。由于实时PCR采用闭管操作，克服了常规PCR的污染问题，使其具有很高的特异性。实时PCR技术尽管有少数假阳性的结果，但其与常规细菌学方法互补使用可提高阳性检出率，仍不失为灵敏度高、特异性强的结核病辅助诊断的有效方法之一。 本研究结果显示， 痰涂片抗酸染色镜检阳性率(30%)较低，是可能因为抗酸染色受痰中细菌数量限制，一般至少每毫升痰液含(5×103)～(1×104)个细菌方可得出阳性结果，且结核病人是间断性排菌，可能造成假阴性。这就要求我们在抗酸染色时要严格控制条件，挑取标本中干酪样或脓性部分，以提高阳性率。
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而实时PCR检测法阳性率明显高于抗酸染色法和改良罗氏培养法，且特异性为100%，这和荧光定量PCR的原理和它所采用的一系列新技术密切相关。尤其是结核病患者经药物治疗或体内出现了细胞壁缺损的L型细菌导致分离培养结果呈阴性时，此方法检测结果仍不受影响。在本实验中我们只用阴、阳性来表示结果，但实时PCR可以做到相对定量，且定量结果可以指导临床用药和疗效评估。实时PCR检测结核抗酸杆菌DNA每毫升痰中只需少量细菌即可获得阳性结果 ，并且在本实验建立过程中，无一例抗酸染色阳性和(或)培养阳性的标本实时PCR检测为阴性。实时PCR是临床上广泛应用的一种基因定量检测技术，使我们获得一个从分子水平确定结核的新方法，为结核的快速诊断提供了有力参考［6］。 【参考文献】
［1］van Leth F，van der Werf MJ，Borgdorff MW. Prevalence of tuberc μLous infection and incidence of tubercμLosis: a re-assessment of the Styblo rμLe［J］. BμLl World Health Organ, 2008,86(1):20～26.
［2］Montenegro SH， Gilman RH， Sheen P，et al. Improved detection of Mycobacterium tubercμLosis in Peruvian children by use of a heminested IS6110 polymerase chain reaction assay［J］. Clin Infect Dis, 2003,36:16～23.
［3］Negi SS， Basir SF， Gupta S. Comparison of the conventional diagnostic modalities， BACTEC cμLture and
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polymerase chain reaction test for diagnosis of tubercμLosis［J］. Indian J Med Microbiol, 2005, 23:29～33.
［4］辛茶香,刘珍琼,熊国亮.荧光定量PCR 技术检测结核分支杆菌DNA的应用价值［J］.国际检验医学杂志,2007,28(3):196～201. ［5］应春妹,汪雅萍,张灏.荧光定量PCR技术在结核分枝杆菌检测中的应用［J］.上海交通大学学报(医学版),1400～1401.
［6］盛青,唐林国,肖芃.荧光定量PCR在结核分枝杆菌检测中的应用价值［J］.现代医院,2007,7(7):11～13.
（学习的目的是增长知识，提高能力，相信一分耕耘一分收获，努力就一定可以获得应有的回报）
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结核分枝杆菌荧光定量PCR检测方法的建立与应用
