结核分枝杆菌荧光定量PCR检测方法的建立与应用
目的 建立结核分枝杆菌的荧光定量PCR检测方法,探讨荧光 PCR检测痰标本中结核分枝杆菌的应用价值。方法 根据结核分枝杆菌基因保守序列设计引物和探针，并构建标准品。对102例培养涂阳的结核痰液标本和45例非结核感染者的痰标本，应用荧光定量PCR法、痰涂片抗酸染色法检测结核分枝杆菌。 结果 荧光定量 PCR、抗酸染色法检测结核分枝杆菌的特异性分别为100%、30%。结论 荧光定量PCR是一种快速、敏感性高、特异性强的结核分枝杆菌辅助诊断方法,具有重要的应用价值。
【关键词】 结核;分枝杆菌;抗酸染色;荧光定量PCR
Establishment and application of fluorescence
quantitative PCR for detection of Mycobacterium tuberculosis. ZHU Yu-lan, WANG Dian-peng, GAO Zhao-xian, et al.
International Travel Agency Health Care Center, Shenzhen Entry and Exit Inspection and Quarantine Bureau,Shenzhen 518033, Guangdong, P. R. China
Abstract：Objective To constitute a method for detection of Mycobacterium tuberculosis by fluorescence quantitative PCR and evaluate the application value of fluorescence quantitative PCR in detection of Mycobacterium tuberculosis in
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sputum. Methods The primers and probe were designed and constitute a standards. The suptum samples from 102 tuberculosis patients and 45 non-tuberculosis patients were detected by fluorescence quantitative PCR and acid-fast stain. Results The positive rates and specificity of fluorescence quantitative PCR, acid-fast stain,were100% and 30% respectively. Conclusion Fluorescence quantitative PCR is a rapid method for diagnosis of tuberculosis, which shows a high specificity and sensitivity. It is a useful tool for diagnosis of tuberculosis in the future.
Key words：Tuberculosis; Mycobacterium tuberculosis; Acid-fast stain; Fluorescence quantitative PCR
结核病是严重危及全球的公共卫生问题之一，自1985年以来结核病疫情在全球范围内急剧上升，据世界卫生组织报道，目前全球有近1/3的人感染了结核杆菌，即20亿人口感染了结核杆菌，其中活动性肺结核病人约2 000万，每年新增结核病人约800～1 000万，每年约有300万人死于结核病［1～3］。结核病已成为导致全世界成人因传染病而死亡的主要疾病之一。我国是全球22个结核病高发国家之一，活动性肺结核病人数居世界第二位。据2000年全国结核病流行病学抽样调查估计，全国现有活动性肺结核病人450万，其中传染性肺结核病人150万［4］。结核病防治是我国乃至全球疾病防治的重要课题。目前，出入境人员体检诊断传染性肺结核的主要方法是通
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过胸部X片检查，加上痰涂片抗酸染色镜检和PPD试验联合检测。由于胸部X片是根据临床症状进行诊断，缺乏病原学依据，加上肺结核与其他肺部疾病在胸片上有相似的地方，容易出现误诊和漏诊；痰涂片抗酸染色的阳性率低，采样不合格标本的阳性率更低，极易出现漏诊；而PPD试验的特异性不强，不能作为确诊肺结核的依据。因此，这三种检测方法的组合模式在检测肺结核上存在着较大的缺陷，易导致传染性肺结核病人的漏诊，而少数肺部疾病或其他部位结核的病人可能出现误诊，降低了出入境人员传染性肺结核监测的效果。分子生物学方法以其简便、快速，特异性高的特点成为结核分枝杆菌检测研究的热点。国内外大量研究证明PCR检测结核分枝杆菌敏感性达到100％，本研究以荧光PCR技术为基础，开发适合传染性肺结核快速诊断模式，结果报告如下。 1 材料与方法 1.1 材料
确诊肺结核病人培养涂阳的结核痰液标本102份。正常人的痰液25份，葡萄球菌、肺炎链球菌、肺炎克雷伯球菌痰液标本共计20份。 1.2 引物与探针
根据对NCBI数据库结核杆菌基因序列分析，找出其保守序列，并且在此区域应用Primer5.0 和Primer express 3.0软件设计引物与探针，探针的5’端标以荧光发射基团FAM标记，靠近3’端标以荧光淬灭基团TAMRA标记 (表1) 。Forward Primer：5’TAGGCGTCGGTGACAAAGG3
’；
Reverse
Primer
：
5
’
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GGGTAGCAGACCTCACCTATGTG3’；Probe：5’CACGTAGGCGAACCCTGCCCA3’。 1.3 仪器
ABI公司的ABI7500荧光Real－time PCR仪。 1.4 痰液DNA提取
1.4.1 痰液样品的预处理
吸取待测痰液200μl放入1.5ml的eppendo管中，加入5mol/L NaOH 500μl，混匀，室温中摇动20min。加入1mol/L NaH2PO4 700μl，混匀(起中和作用)，10 000rmp离心5min。去上清液，补加TE至100μl，混匀，加入20μl浓度为50mg/ml的溶菌酶。置37℃消化30min。
1.4.2 DNA的提取
细胞复合裂解液置65℃水浴中，使其中的结晶溶解。将300μl结晶已溶解的细胞复合裂解液加入到上述预处理好的痰液样品中，混璇器震荡混匀20秒，置65℃水浴中反应20min。加入200μl蛋白沉淀液，上下颠倒5～6次使两者混匀。16 000rmp离心3min。将上清液(约500μl)转移至新的离心管中，加入等体积异丙醇，此时可见透明的絮状物，混匀后16 000rmp离心3min，倾去上清。加入200μl 70％的乙醇溶液，来回倒置，清洗管壁，16 000rmp离心3min。吸去70％乙醇，倒置离心管于干净的滤纸上，乙醇挥发完全，加入30μl DNA溶解液，快速漩涡震荡1～2秒，使沉淀的DNA完全溶解。 1.5 标准品的制备
标准品包括：阳性定量参考品、阴性质控品、临界阳性质控品和
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强阳性质控品。以结核杆菌阳性DNA样品2μl做为PCR反应的模板，加入PCR反应液23μl，PCR反应液中含有10x PCR Buffer 3μl、25mmol/L MgCl2 1.2μl、10mmol/L dNTPs 3μl、4U/μl Taq DNA聚合酶0.5μl及10pmol/L上、下游引物各1μl，灭菌双蒸水13.3μl。于PT-200 PCR扩增仪进行如下循环：先94℃预变性4min；然后94℃ 30s，58℃ 30s，72℃ 30s，30个循环；最后72℃延伸10min。PCR产物经1.5％琼脂糖电泳，凝胶回收试剂盒回收PCR电泳产物，与线性化后的pMD18-T载体（Invitrogen公司）4℃下连接12～16h，连接反应体系中含有PCR凝胶回收产物3μl、连接缓冲液5μl、线性化后的pMD18-T载体1μl和T4连接酶1μl，连接产物转化感受态大肠杆菌DH5ɑ，转化后的细胞涂布于含有氨苄青霉素抗性的1.5％琼脂固体LB培养基上，37℃倒置培养12～16h，用灭菌牙签挑取单克隆，接种于含50mg/ml氨苄青霉素的5ml液体LB培养基中，200rpm摇床37℃震摇过夜；取1.6ml过夜培养物，抽提质粒，经PCR初步鉴定，对阳性克隆进行测序分析，将筛选出的阳性菌株进一步扩增，抽提质粒DNA，用核酸蛋白紫外分析仪准确定量(连续测定4次，每次重复4管，取均值)，并进行10倍系列稀释，得到浓度分别为108、107、106、105copies／ml的4个标准品，即为阳性定量参考品。阴性质控品以生理盐水制备，强阳性质控品和临界阳性质控品根据浓度和拷贝数以标准品经灭菌水稀释后制得。 1.6 Taq-man探针实时PCR及反应条件
反应液总体系为20μl，每份反应液中含有2×Probe－PCR
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