实验一 血清γ球蛋白的分离纯化
一、实验目的与要求
1. 掌握分离纯化蛋白质的基本原理和基本过程
2. 熟悉盐析、离心、层析、电泳等生物化学基本技术在蛋白质分离纯化中的综
合应用。
3. 学会设计和制定分离纯化蛋白质的实验方法、技术路线和质量监控和保证措
施。
二、实验原理
血清蛋白有3000多种，可粗略分为清、球蛋白两大类，球蛋白只是球蛋白中的一个亚类。欲用常规方法获得，可先用半不饱和硫酸铵从血清中盐析出球蛋白，接着用葡聚糖凝胶G-25层析柱（Sephadex-25）脱去球蛋白中的盐分（硫酸铵），最后用DEAE（二乙基氨基乙基）纤维离子交换层析住，便可直接从脱盐的球蛋白溶液中分离纯化出γ球蛋白。原理如下图所示：
三、实验步骤
γ球蛋白的分离纯化
1. 3 mL，4℃预冷血清，加入3 mL 4℃预冷的饱和硫酸铵（边加边混匀），静
置10 min。
2. 3500 rpm离心15 min，弃上清，沉淀溶于少量的水，留0.5 mL测[Pr]。 3. 上Sephadex G-25柱，0.02 mol·L－1 pH 6.5的NH4AC缓冲液洗脱，每管收集
2 mL。
4. 浓度最高管（留少量电泳用，留0.5 mL测[pr]），上已平衡好的DEAE-32
柱，0.02 mol·L-1 pH6.5 NH4AC缓冲液洗脱。
5. 用20%磺基水杨酸检测是否有蛋白流出，每管收集2 mL。 6. 收集的蛋白质溶液即为γ球蛋白。 电泳鉴定
1. 安装垂直板型电泳装置。
2. 配分离胶，加胶高度距样品槽模板下缘约0.5-1 cm，水封，聚合30 min，去
水（滤纸）。
3. 配浓缩胶，加胶，插梳子，聚合15 min。
4. 去夹子，去胶条，连接电极槽，加电极缓冲液，拔梳子。 5. 加样，将样品与样品处理液1:1混合后上样。
6. 电泳，上槽接负极，下槽接正极，40 mA/板。待指示剂迁移至下端0.5 cm时，
停止电泳。
7. 剥胶，于大培养皿。
8. 染色，加入染色液使胶完全浸入，染色。 9. 拍照
四、实验结果与分析
65 4 3 2 1
注：1泳道为血清样，2 3泳道为脱盐样，4 5 6泳道为样品样。
结果分析：条带不整齐，可能是倒胶的时候没有到平。血清样和脱盐样各组分分离结果不佳，可能是上样过多。样品样的条带不太清晰，说明其中的γ球蛋白很少，可能在第二次分离中被稀释。
实验二 等电聚焦电泳法测定蛋白质等电点
一、实验目的
1、掌握等电聚焦电泳法的基本原理。 2、巩固圆盘电泳的基本操作。
3、学习用该方法测定蛋白质的等电点。
二、实验原理
首先应用电流在凝胶溶液中建立稳定的PH梯度，然后添加蛋白样品，利用电场，蛋白质移动到特定的等电点(PI)，同样等电点的蛋白质可以通过凝胶电泳进行进一步的分离。
三、实验方法
1、取凝胶管2根。 2、置于胶凝胶管架。 3、配胶，加胶。
4、聚合20-25分钟，至界面再次出现。 5、去水，置于圆盘电泳槽中。 6、封住多余空穴。
7、电泳，在下槽中装入2％氢氧化钠溶液。避免管下有气泡。在上槽中加入5％磷酸缓冲液，去除管上气泡。上槽接电泳仪的正极，下槽接负极，打开电源，稳压160 V电泳至电流无限接近于0，关闭电源。
8、剥胶，电泳结束后取下凝胶管，用清水将两端电极液洗净，在凝胶的正端插入毛细管，作为标记。
9、1根胶条：量长度，置10％TCA中固定；1根胶条：从正极端开始，每隔0.5 cm切割，依次放入盛有１ml DW的试管中浸泡。 10、测定
固定胶条：固定后长度，蛋白质沉淀线距正极端距离 切割胶条：测各管pH值。 11、PH梯度的制作
12、蛋白质样品等电点的制作。 五、实验结果
1、求出蛋白质聚焦部位距凝胶条正极端的实际长度为：
固定前凝胶条的长度
固定后的蛋白质区带中心距凝胶条正极端的距离× 固定后凝胶条的长度 =3.5×9.5/8.6=3.65 cm
2、计算出蛋白质聚焦部位距凝胶条正极端的实际长度后，直接从pH梯度曲线上求出该蛋白质等电点。 长度 PH 3 4 4 5 5 5 5 6 6 6 7 7 7 7 8 8 8 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 8.5 9.0 8 9.5 9 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 0 2 4 6 8 10 PH 分析：蛋白质聚焦部位距凝胶条正极端的实际长度为3.65 cm，从PH梯度曲线中可以看出该待测蛋白的等电点为5，由于我们测量PH时用的是PH试纸，数值不够精确，所以最后得到的PH值只是估计值。
长度cm
高级生化实验报告
