分子细胞遗传学实验
实验一 实验二 实验三 实验四 实验五
质粒DNA的提取 琼脂糖凝胶电泳检测DNA 显微镜使用与摄影技术 植物染色体制片与观察
荧光原位杂交实验（原位杂交）
实验一 质粒DNA的提取
一、实验目的
通过本实验学习和掌握碱裂解法和试剂盒方法提取质粒。
二、实验原理
碱裂解法提取质粒是根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA在拓扑学上的差异来分离它们。在pH值介于12.0～12.5这个狭窄的范围内，线性的DNA双螺旋结构解开而被变性，尽管在这样的条件下，共价闭环质粒DNA的氢键会被断裂，但两条互补链彼此相互盘绕，仍会紧密地结合在一起。
当加入pH4.8的乙酸钾高盐缓冲液恢复pH至中性时，共价闭合环状的质粒DNA的两条互补链仍保持在一起，因此复性迅速而准确，而线性的染色体DNA的两条互补链彼此已完全分开，复性就不会那么迅速而准确，它们缠绕形成网状结构，通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA，蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。
本实验用的试剂盒是天根公司的普通质粒小提取试剂盒。该方法的基本原理是，在高盐状态下，DNA纯化树脂ΜLtraPureTM专一性地吸附DNA；而在低盐或水溶液状态下，DNA被洗脱下来。
三、仪器、材料与试剂
1．仪器：恒温培养箱，恒温摇床，台式离心机，高压灭菌锅。 2．材料：含质粒的大肠杆菌，1.5mL 离心管，吸头，吸样器。 3．试剂：质粒小量制备试剂盒(质粒DNA小量提取试剂盒, 天根公司)
常用碱法提取质粒的溶液的参考配方： Solution I 50mmo1／L 葡萄糖
25mmo1／L Tris?HCl(pH8.0)
10 mmo1／L 乙二胺四乙酸(EDTA)pH8.0 Solution II
0.4mo1／LNa0H，2％SDS(十二烷基硫酸钠)，使用前等体积混合 Solution III 5mo1／L 乙酸钾 60mL 冰乙酸 11.5mL 水 28.5mL TE缓冲液
10mmo1／L Tris?HCl
1mmo1／L EDTA(pH8.0) RNA酶(RNA酶A)
Tris?HCl(pH7．5)、15mmo1／L NaCl中，配成10 mg／mL的浓度，于100℃加热15min， 缓慢冷却至室温，保存于-20℃。 70%乙醇（放-20℃冰箱中，用后即放回）
四、实验步骤
I 质粒扩增
将2mL含相应抗生素的LB液体培养基加入到试管中，接入含质粒的大肠杆菌，37℃振荡培养过夜。
II 质粒的提取（试剂盒操作方法）
1、将3～5ml菌液12,000rmp离心30秒收集沉淀（菌体）。 （如果用1.5ml或2ml离心管则需要反复离心2～3次）
2、倒掉上清，将沉淀（菌体）完全悬浮于250μL悬浮液（溶液P1）中。
上清要尽可能去除干净，可用滤纸吸干。沉淀要用混旋器完全悬浮，否则将直接导致下一步的裂解不彻底，进而影响质粒DNA的产量与纯度。
3、加入150μL裂解液（溶液P2），轻柔地颠倒混匀10次左右，溶液逐渐变得粘稠、清亮。
不可用混旋器剧烈振荡，否则会使质粒DNA断裂时间不宜超过5min，否则会造成染色体DNA的污染。
4、加入150μL中和液（溶液P3），轻柔地颠倒混匀10次左右。 此时可见到白色絮状的染色体DNA及细菌碎片。
5、向吸附柱（吸附柱放入收集管中），加入500μL的平衡液BL, 12,000rmp离心1m，倒掉收集管中的废液。
6、12,000rmp离心8～10mim，将上清液小心转入到吸附柱（吸附柱放入收集管中），12,000rmp离心30s，倒掉收集管中的废液。
7、 将纯化柱重新套入废液收集管中，加入600μL漂洗液PW（请先检查是否加入无水乙醇），12,000rmp离心1min，倒掉收集管中的废液。
如果纯化柱底部残留有异丙醇（或乙醇），可用滤纸吸干。否则将影响以后的酶促反应。 8、重复第7步1次，尽可能将杂质去除。
9、取出纯化柱，将其套入一个干净的1.5ml离心管，加入50μL TE缓冲液于（或灭菌的ddH2O）纯化树脂上，不能沾在管壁上。室温下放置5min后，13,000rmp离心1min。 10、离心管中收集的液体就是洗脱下来的质粒DNA, 取3～5μL电泳，检测其纯度和目测定量。－20℃保存备用。 若有RNA污染，可加入0.5μLRNaseA(10mg/ml)，37℃保温10～
30min。
Ⅲ、质粒的琼脂糖凝胶电泳
取10μL洗脱液（质粒DNA）与3μL溴酚蓝混合，用吸样器加入1% Agarose 作凝胶电泳分析。
五、实验结果
实验二 琼脂糖凝胶电泳检测DNA
一、实验目的
通过本实验学习琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法和技术。
二、实验原理
DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。DNA分子在高于等电点的pH 溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速度向正极方向移动。在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，即DNA分子本身的大小和构型。具有不同的相对分子质量的DNA片段泳动速度不一样，可进行分离。DNA分子的迁移速度与相对分子质量的对数值成反比关系。
凝胶电泳不仅可分离不同相对分子质量的DNA，也可以分离相对分子质量相同，但构型不同的DNA分子。如上次实验提取的HVG18质粒，有3种构型：超螺旋的共价闭合环状质粒DNA(covalelltly closed circular DNA，简称cccDNA)，开环质粒DNA，即共价闭合环状质粒DNAl条链断裂，(open circular DNA，简称ocDNA)，线状质粒DNA，即共价闭合环状质粒DNA 2条链发生断裂(linear DNA，简称LDNA)。这3种构型的质粒DNA分子在凝胶电泳中的迁移率不同。因此电泳后呈3条带，超螺旋质粒DNA泳动最快，其次为线状DNA，最慢的为开环质粒DNA。
三、仪器、材料与试剂
1．仪器：恒温培养箱，琼脂糖凝胶电泳系统，台式离心机，高压灭菌锅，紫外核酸检
测仪。
2．材料：三羟甲基氨基甲烷(Tris)，冰醋酸，乙二胺四乙酸(EDTA)，溴酚蓝，蔗糖，
琼脂糖，溴化乙锭，DNA marker，HVG18质粒。
3．试剂：
① 50xTAE(50倍体积的TAE贮存液)，配1000mL 50xTAE： Tris 242 g
冰醋酸 57.1 mL 0.5mol／L EDTA 100 mL pH 8.0
② 凝胶加样缓冲液(6x)： 溴酚蓝 0.25％ 蔗糖 40％ 二甲苯青 0.25％ ③ 琼脂糖
④ 溴化乙锭溶液(EB) 0.5ug／mL
四、 实验步骤
1、制备琼脂糖凝胶
按照被分离DNA的大小，决定凝胶中琼脂糖的百分含量。可参照下表：
琼脂糖凝胶浓度％ 0.3 0.6 0.7 0.9 1.2 1.5 2.0
线性DNA的有效分离范围／kb 5～60 1～20 0.8～10 0.5～7 0.4～6 0.2～4 0.1～3
称取1.0g琼脂糖，放入锥形瓶中，加入100mL 1xTAE缓冲液，置微波炉或水浴加热
2、胶板的制备 3、加样
用移液枪将已加入上样缓冲液的DNA样品加入加样孔(记录点样顺序及点样量)。
4、电泳
接通电泳槽与电泳仪的电源(注意正负极，DNA片段从负极向正极移动)。DNA的迁移速度与电压成正比，最高电压不超过5V／cm。
在紫外灯(360nm或254nm)下观察染色后的电泳凝胶。DNA存在处应显出桔红色荧光条带(在紫外灯下观察时应戴上防护眼镜，紫外线对眼睛有伤害作用)。 当溴酚蓝染料移动到距凝胶前沿1～2cm处，停止电泳。
5、染色
将电泳后的凝胶浸入溴化乙锭染色液(在200mL1xTAE缓冲液中加两滴溴化乙锭储存液即可)。注意：溴化乙锭为致癌物，须戴一次性塑料薄膜手套操作，并小心污染环境。也可将EB溶液直接加入凝胶溶液中。
分子细胞遗传学实验
