猪圆环病毒引起的断奶后多系统衰竭综合征诊断方法标准的建立
Diagnostic methods of porcine postweaning multisystemic wasting syndrome
崔尚金*,李曦,符芳,曲连东，童光志
（中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 疫病诊断与流行病学中心 哈尔滨 150001）
前言
猪断乳后多系统衰竭综合征（PMWS）是一种由猪圆环病毒2型（porcine circovirus 2，PCV2）引起的新病。猪圆环病毒(PCV)是1974年在猪肾传代细胞系 PK-15中发现的一种污染病毒，该病毒不产生细胞病变效应（CPE），无致病性，命名为PCV1；而后在猪断奶后多系统衰竭综合征(PMWS)中分离的猪圆环病毒，有致病性，命名为PCV2。PMWS主要感染1-5月龄猪，发病率为4-30%，致死率为70-80%。断乳猪和生长猪临床表现为进行性消瘦、呼吸困难、皮肤苍白、黄疸、腹泻和体表淋巴结肿大。多种组织发生广泛的肉芽肿性炎症，肉芽肿性淋巴结炎、间质性肺炎、肝炎、间质性肾炎和胰腺炎。病理组织学变化主要是淋巴细胞组织不同程度的衰竭萎缩，淋巴细胞减少。世界许多养猪国家都发生了本病，我国也有本病流行。PMWS严重影响猪的生长发育，但对其发病机理，传染源等问题还不完全清楚， 本病没有有效的治疗方法，抗生素对PMWS患猪无效。但抗生素的使用和良好的饲养管理，有助于控制二重感染。目前还没有疫苗可供应用。 1 范围
本标准规定了猪断奶后多系统衰竭综合征（PMWS）的诊断方法。 本标准适用于猪断奶后多系统衰竭综合征的诊断。 2 诊断方法的种类和选用
确诊PMWS需要三个条件：存在相应的临床症状，特征性病理变化，从病灶中检出PCV2病原。根据临床症状和病理变化只可作出初步诊断，确诊必须依靠实验室检查。目前已建立和应用的实验室诊断技术有病毒的分离与鉴定、聚合酶链式反应（PCR）、间接免疫荧光试验（IFA）、间接酶联免疫吸附试验
（IELISA）、免疫组织化学试验（IHC）等。病毒的分离与鉴定多用于急性病例的确诊和新疫区的确定。PCR方法用于检测PCV病毒的核酸，应用型特异性引物可对PCV1和PCV2定型。IFA、间接ELISA方法主要用于检测PCV病毒抗体。IHC方法主要用于检测PCV病毒抗原，并进行病毒的组织学定位。 本标准指定上述五种实验室诊断技术为我国生猪PMWS的诊断方法，保证了我国对PMWS的诊断与国外的一
致性。在实际应用时，可根据需要和条件，从中选用1-2种方法即可。 3 临床症状和病理变化 3.1 临床症状
根据以下主要的临床症状可作出初步临床诊断:最常见的、也是确诊PMWS所必需的临床症状是衰竭和生长发育不良, 进行性消瘦；其它症状如精神不振、食欲不佳、被毛粗乱，消化不良、肌肉衰弱无力、腹泻、皮肤苍白、黄疸，还有咳嗽、喷嚏、呼吸困难等呼吸系统症状。体表淋巴结，特别是腹股沟淋巴结肿大。其它不常见的症状有发热、嗜睡、胃溃疡、中枢神经紊乱、猝死。这些临床症状不会同时在同一头猪上出现。发病猪场在一段时间内会出现大多数症状。一些临床症状由于继发感染或双重感染而恶化。 3.2 病理变化 3.2.1 剖检变化
最显著的病变是全身淋巴结，特别是腹股沟淋巴结、肠系膜淋巴结、气管、支气管淋巴结及下颌淋巴结肿大到2－5倍，有时可达10倍。在PMWS感染猪也观察到正常或萎缩的淋巴结。切面硬度增大，均匀的苍白色，集合淋巴小结也肿大。发生细菌感染，则淋巴结可见炎症和化脓病变，使病变复杂化。 ———————————
作者简介：崔尚金：博士，副研究员，目前主要从事动物疫病诊断、流行病学、地理信息系统GIS和外来病的研究工作. *通讯作者，E-mail: ;
肺肿胀不崩陷，有散在，大而隆起橡皮状硬块。严重的病例，肺泡出血，部分病例尖叶和心叶萎缩或固质化。
脾中度肿大，呈肉变。
半数病例肝脏无明显异常，其它病猪表现不同程度的虎斑状外观，并伴有轻度或中度萎缩，有的病例肝肿大。
肾脏水肿，苍白，被膜下有白色坏死灶，盲肠和结肠粘膜充血或瘀血。
许多PMWS感染猪有支气管肺炎和胃溃疡，但胃溃疡和PCV2感染无直接关系，胃溃疡发生是多原因的。支气管肺炎与细菌感染有关，然而胃内病灶引起内出血，导致部分PMWS猪死亡的原因，也是导致皮肤苍白的原因。
3.2.2 组织学变化
淋巴结的皮质及副皮质区显著扩张，有单核/巨噬细胞，组织细胞浸润，有时还散布着大量的多核巨细胞。淋巴细胞减少，淋巴结基质常增生或有嗜酸性细胞浸润。淋巴滤泡有由组织细胞、类上皮细胞、巨噬细胞、多核巨细胞、嗜酸性白细胞、淋巴细胞集聚形成的肉芽肿。其它组织有广泛的淋巴细胞、单核细胞、组织细胞浸润。 4 病毒的分离与鉴定 4.1 材料准备
4.1.1 器材： 25cm2（T25）细胞培养瓶、直径15mm盖玻片、55mm圆形有盖平皿、微量移液器、恒温水浴箱、二氧化碳（CO2）恒温箱、普通冰箱及低温冰箱、离心机及离心管、组织研磨器、孔径0.2μm的微孔滤膜、普通光学显微镜。
4.1.2 试剂：RPMI1640营养液、犊牛血清、青霉素（105ug/mL）与链毒素（105ug/mL）溶液、氯仿、300mM D（+）氨基葡萄糖、Hanks平衡盐溶液。 4.1.3细胞培养物：无PCV污染的猪肾传代细胞PK-15。 4.1.4样品
4.1.4.1 样品的采取和送检：在发病早期，无菌采取病猪的血清。对病死猪立即采取肺、扁桃体、淋巴结、脾、肾、肝等组织数小块，置冰瓶内立即送检。不能立即检查者，应放-25℃～-30℃冰箱中，或加50%甘油生理盐水，4℃保存送检。
4.1.4.2 样品的处理：若样品经PCR检测为PCV阳性，按如下方法进行处理。血清可直接使用。肺、淋巴结、扁桃体、脾、肾、肝等组织混合，组织剪碎后研磨成糊状，加入含有105ug/ml链霉素，105ug/ml青霉素，两性霉素B 200ug/ml的RPMI1640营养液，制成10%（W/V）悬液，-20℃反复冻融3次或-70℃冻融1次，2000g离心30min。吸取上清液，转移到新的离心管中，每1ml上清加入50ul氯仿，室温下不断混合10 min，1000g离心10 min。怀疑有细菌污染的样品，也可用0.2μm微孔滤膜过滤处理。取上清，注意避免吸出氯仿，分装，-70℃保存。
4.2 操作方法
4.2.1 接种样品：取2ml上清液加到18 ml PK-15细胞悬液，细胞浓度达到5×104个/ml，培养液用10%犊牛血清和1%双抗的RPMI1640。将12ml病毒细胞混合悬液分装到2个25cm2（T25）通气的细胞培养瓶中，每瓶6ml。6ml加入到装有直径15mm盖玻片的55mm圆形有盖平皿中，置于37℃ 5% CO2培养箱。 4.2.2
细胞处理：接种后18-24h长成50-60%单层细胞， 倾去培养瓶中培养液，加入2-3ml预热300
mM D（+）氨基葡萄糖，能覆盖细胞足以，放入37℃培养箱继续作用30min。去除氨基葡萄糖，以Hanks平衡盐溶液冲洗2-3次，加入含有2%血清的维持液，放回培养箱。 4.2.3 4.2.4
继续培养48h后，用间接免疫荧光法对平皿中的玻片培养物进行染色，以监控病毒生长。 重复感染：取1个T25瓶反复冻融3次。用胰酶消化另一个T25瓶内细胞，悬于21ml生长液，
再加入第一瓶中的细胞悬液6ml，取15ml 接到一个75cm2(T75)瓶，6ml接到一个T25瓶，6ml接种到有盖玻片的平皿中。 4.2.5
72-96h后取平皿中玻片进行免疫荧光染色，观察病毒的生长情况。将T25瓶反复冻融3次，接
种到T75瓶内，继续传代。取少量细胞悬液进行PCR的检测。 4.3 结果的判断和解释
在第一代培养时，若IFA检测为阴性应继续盲传，第三代培养IFA、PCR检测为阳性，则判定为PCV病毒分离阳性。
5 聚合酶链式反应（PCR） 5.1 材料准备
5.1.1 器材：微量移液器、吸头、离心机、研磨器、PCR仪、电泳仪、恒温水浴锅、恒温干燥箱等。 5.1.2 试剂： Tris饱和酚、氯仿、10%SDS、50ug/ml 蛋白酶K、无水乙醇或异丙醇、3 MpH5.2醋酸钠、75%乙醇；Taq DNA聚合酶、dNTP(2.5mmol/l)、10×Buffer、灭菌去离子水、特异性引物、标准DNA分子量的Marker、上样缓冲液。
5.2 病毒DNA的提取：
5.2.1 样品的处理：取发病猪脾、淋巴结、肝、肾等脏器剪碎加入适量生理盐水研磨制成组织匀浆，反复冻融3次，3000g离心20min，吸取上清用于提取DNA 。发病猪的全血和血清可直接进行检测。 5.2.2 核酸提取：
5.2.2.1 取500ul组织冻融上清、全血或血清加入25ul 10% SDS，5ul蛋白酶K，振荡混合数次，置37-56℃水浴锅中2-3小时，其间振荡混合几次。
5.2.2.2 酚抽提：每管中加入200ul酚，颠倒混合30s,12000rpm离心10min。吸出上层水相，转移到新管。
5.2.2.3 酚/氯仿抽提：每管分别加入100ul和100ul氯仿，颠倒混合30s,12000rpm离心10min。吸出上层水相，转移到新管，并作好标记。
5.2.2.4 氯仿抽提：每管分别加入200ul氯仿，颠倒混合30s,12000rpm离心10min。吸出上层水相，转移到新管，并作好标记。
5.2.2.5 每管中加入2.5倍无水乙醇，1/10体积的3M pH5.2 NaAc（醋酸钠），混合数次，-20℃沉淀2h或过夜。或每管中加入等体积的异丙醇，1/10体积的3M pH 5.2 NaAc（醋酸钠），混合数次，室温下沉淀20-30min。 5.2.2.6
13000rpm离心10-15min,倒掉管内液体，在滤纸上吸干，不要求完全干燥。
5.2.2.7 每管中加入100-200ul 70%的乙醇,12000rpm离心5min。倒掉管内液体,在滤纸上吸干，放入37℃温箱烘干。
5.2.2.8 20-40ul 灭菌水溶解沉淀，反复吹打沉淀，促进沉淀溶解。
5.2.3 PCR扩增：PCR反应液应在冰上配制，配液顺序：灭菌水，10×buffer，dNTP，引物，Taq酶，样品DNA。
5.2.3.1 50ul 的反应体系：
Taq (5U/ul)： 0.4-0.5ul
猪圆环病毒引起的断奶后多系统衰竭综合征诊断方法标准的建立
