番茄黄化曲叶病毒侵染危害海南番茄及其分子特征

由天下分享时间：2024/12/17 14:36:20 加入收藏我要投稿点赞

南方农业学报JournalofSouthernAgriculture2024，51（08）：1970-1976·1970·南方农业学报ISSN2095-1191；CODENNNXAABhttp://www.nfnyxb.com51卷DOI：10.3969/j.issn.2095-1191.2024.08.023番茄黄化曲叶病毒侵染危害海南番茄

及其分子特征

汤亚飞1，，周

洋3，张丽1，李正刚1，佘小漫1，，于

蓝国兵1，邓铭光1，何自福1，

琳1，

510640；

（1广东省农业科学院植物保护研究所，广州

510640；2广东省植物保护新技术重点实验室，广州

572600）

东方市农业服务中心，海南东方

摘要：【目的】明确引起海南三亚、东方和陵水番茄黄化曲叶病的病毒分子特征，为防控该病害提供科学依据。【方法】以2024年2月从海南三亚、东方和陵水采集的15份疑似番茄黄化曲叶病样本为材料，采用菜豆金色花叶病毒属病毒的通用简并引物AV494/CoPR对15份样本进行PCR检测，并对PCR检测为阳性的样本进行滚环扩增（RCA）及基因克隆，获得侵染海南三亚、陵水和东方番茄的病毒基因组全序列，进而在GenBank数据库BLASTh程序进行相似性比对，利用SDT1.2的MUSCLEalignment进行序列相似性比较分析，采用MEGA6.0的邻接法（Neighbor-joining，NJ）构建系统发育进化树，明确所获得病毒分离物与已报道分离物的亲缘关系。【结果】获得侵染海南三亚、陵水和东方番茄的3个番茄黄化曲叶病毒（Tomatoyellowleafcurlvirus，TYLCV）分离物基因组全序列，其大小均为2781nt，编码6个开放阅读框（ORF），其中病毒链上AV1和AV2基因，互补链上AC1、AC2、AC3和AC4基因。相似性比对分析结果表明，TYLCV海南分离物与墨西哥和美国分离物的相似性在99.0%以上，与来自我国不同省（市）的14个TYLCV分离物的相似性在98.0%以上。系统发育进化分析显示，海南三亚、陵水和东方3个分离物与墨西哥、美国及我国北京和江苏分离物聚集在一个小分支，进一步与来自我国其他12个省（市）、韩国、哥斯达黎加和澳大利亚的分离物形成一个分支。【结论】侵染海南番茄的TYLCV可能来自我国大陆的番茄等种苗和烟粉虱带毒传入，也有可能来自墨西哥和美国等其他国家。

关键词：番茄黄化曲叶病毒；分子鉴定；序列分析；海南中图分类号：S432.41

文献标志码：A

文章编号：2095-1191（2024）08-1970-07

TomatoyellowleafcurlvirusinfectingtomatoinHainan

anditsmolecularcharacteristics

TANGYa-fei1，，ZHOUYang3，ZHANGLi1，LIZheng-gang1，SHEXiao-man1，，

YULin1，LANGuo-bing1，DENGMing-guang1，HEZi-fu1，

（1PlantProtectionResearchInstitute，GuangdongAcademyofAgriculturalSciences，Guangzhou510640，China；

GuangdongProvincialKeyLaboratoryofHighTechnologyforPlantProtection，Guangzhou510640，China；

AgriculturalServiceCenterofDongfang，Dongfang，Hainan572600，China）Abstract：【Objective】ThisstudywastoidentifythemolecularcharacterizationofTomatoyellowleafcurlvirus（TY-LCV）thatcausedtomatoyellowleafcurldiseaseinSanya，DongfangandLingshuiofHainan，inordertoprovidescien-tificbasisforpreventionandcontrolofthediseaseinthearea.【Method】InFebruary，2024，15suspecteddiseasedtomato

sampleswerecollectedfromSanya，DongfangandLingshuiofHainan.The15samplesweredetectedbyPCRusingtheuniversaldegenerateprimersAV494/CoPRforBegomoviruses.ThePCRpositivesampleswereamplifiedbyrollingcircleamplification（RCA）andclonedtoobtainwholegenomesequencesofvirusisolatedfromtomatoinSanya，LingshuiandDongfang.TheseobtainedsequencesidentitywascomparedandanalyzedusingBLASTonGenBankdatabase.PairwisenucleotidesequenceidentitiesweredeterminedusingSDT1.2withMUSCLEalignment.Phylogeneticanalysiswascon-ductedusingMEGA6.0withneighborjoiningmethodtoclarifythegeneticrelationshipbetweenisolatesofobtainedvirus收稿日期：2024-12-16基金项目：国家重点研发计划项目（2024YFD0201209）；广东省基础与应用基础研究基金项目（2024A1515012150）；广州市科技

计划项目（202404010173）；广东省现代农业产业共性关键技术研发创新团队建设项目（2024KJ134）

作者简介：*为通讯作者，何自福（1966-），研究员，主要从事植物病理研究工作，E-mail：hezf@gdppri.com。汤亚飞（1980-），主要

从事蔬菜病毒研究工作，E-mail：yf.tang1314@163.com

8期汤亚飞等：番茄黄化曲叶病毒侵染危害海南番茄及其分子特征

·1971·andthereportedisolates.【Result】ThreewholegenomesequencesofTYLCVisolatedfromtomatoinSanya，LingshuiandDongfangofHainanwere2781nucleotides（nt）longandencodedsixopenreadingframes（ORFs）.TheAV1andAV2werelocatedonthevirionsenseDNAstrand，whereas，theAC1，AC2，AC3，AC4geneswerelocatedonthecom-plementarysensestrand.TheresultsofidentitycomparisonshowedthatTYLCVisolatedfromHainansharedover99.0%ntidentitieswithMexicoisolateandUSAisolate，andover98.0%ntidentitieswiththe14isolatesfromdifferentprovincesormunicipalitiesofChina.TheresultofphylogeneticanalysisshowedthatSanya，LingshuiandDongfangisolatesclus-teredwithisolatesofTYLCVfromMexico，USA，BeijingandJiangsuofChinatoformauniqueclade，furtherclusteredwithallisolatesfromother12provincesormunicipalitiesofChina，SouthKorea，CostaRica，Australiatoformaclade.【Conclusion】TYLCVinfectingtomatoinHainanshouldcomefromotherareasofChina，orMexico，theUnitedStatesandothercountriesbytransmittingthroughseedlingandwhitefly.

Keywords：Tomatoyellowleafcurlvirus；molecularidentification；sequenceanalysis；HainanFoundationitem：NationalKeyResearchandDevelopmentProgramofChina（2024YFD0201209）；GuangdongBasicandAppliedBasicResearchFoundation（2024A1515012150）；GuangzhouScienceandTechnologyProject（202404010173）；GuangdongModernAgriculturalCommonKeyTechnologyResearchandDevelpmentInnovationTeamBuildingProject（2024KJ134）

0引言

【研究意义】番茄（Solanumlycopersicum）是海南冬种北运蔬菜作物之一，年种植面积约6667ha，主要分布在陵水、东方、昌江和定安等市（县），是当地农民增收致富的重要经济作物。番茄黄化曲叶病是全球番茄生产上一种毁灭性病害，已在热带亚热带地区造成严重损失（Hanssenetal.，2010）。2008年，海南省海口市发生番茄黄化曲叶病（Zhangetal.，2010），近年来在海南多个番茄产区暴发流行，已造成巨大经济损失。因此，对引起海南番茄黄化曲叶病的病毒种类进行鉴定，明确其分子特征，可为该病毒病监测与防控提供依据，同时对促进海南番茄产业持续健康发展具有重要的指导意义。【前人研究进展】番茄黄化曲叶病是由烟粉虱传播的双生病毒侵染引起（朱晓林等，2024），但世界各地发生的番茄黄化曲叶病的病原病毒并不相同，国际上已报道可引起番茄黄化曲叶病的病毒有80多种（Brownetal.，2015），我国至少有16种（熊艳等，2011；Yangetal.，2011；Dingetal.，2016），其中番茄黄化曲叶病毒（To-matoyellowleafcurlvirus，TYLCV）分布最广。TY-LCV最早在以色列番茄中被发现，目前已扩散到中东、地中海沿岸、非洲、美洲、澳洲和亚洲等多个国家和地区（MorionesandNavas-Castillo，2000），是引起全球番茄黄化曲叶病的主要病原病毒之一。2006年，该病毒传入我国上海（Wuetal.，2006），之后在浙江、江苏、山东等20个省（区）发生（姜静等，2024；汤亚飞等，2024），造成严重的经济损失，已成为引起我国长江流域及其以北番茄产区黄化曲叶病的优势病毒种类。自从番茄黄化曲叶病在海南省发生以来，有研究者对引起海南番茄黄化曲叶病的病毒进行鉴定。Zhang等（2010）从2008年采集于海南海口

的番茄病样中鉴定出海南番茄曲叶病毒（Tomato

leafcurlHainanvirus，ToLCHnV）；林韶东（2013）从海南三亚崖城镇和乐东黄流镇番茄上检测到ToL-CHnV和中国胜红蓟黄脉病毒（AgeratumyellowveinChinavirus，AYVCNV）；班一云（2017）从海南番茄病样上检测到中国番茄黄化曲叶病毒（TomatoyellowleafcurlChinavirus，TYLCCNV）。目前尚未见在海南番茄上检测到TYLCV的相关报道。【本研究切入点】2024年2月，本研究团队在海南省三亚市、东方市和陵水县番茄产区调查发现，田间番茄病株表现出严重的黄化、曲叶症状，调查田块的发病率达100%。种植者反映近几年番茄黄化曲叶病在海南省发生非常严重，给种植户带来惨重的经济损失，但具体是何种病毒种类引起该病害大暴发尚不明确。【拟解决的关键问题】采用菜豆金色花叶病毒属病毒的通用简并引物AV494/CoPR（WyattandBrown，1996；何自福等，2004）对海南省三亚市、东方市和陵水县番茄产区的疑似番茄黄化曲叶病样本进行PCR检测，并对PCR检测为阳性的病样进行滚环扩增（Rollingcircleamplification，RCA），再进一步通过分子克隆和序列分析，明确引起海南番茄黄化曲叶病的病毒分子特征，为防控该病害提供科学依据。

1材料与方法

1.1试验材料

1.1.1样品采集于2024年2月从海南三亚、陵水和东方番茄产区采集田间表现典型黄化曲叶症状（图1）的番茄病样叶片15份，样本按采样地点做好标记，带回实验室用于检测；以人工注射接种TYLCV侵染性克隆引起发病的番茄植株叶片为阳性对照（CK＋），室内未接种的健康番茄植株叶片为阴性对照（CK－）。

·1972·南方农业学报51卷图1海南番茄黄化曲叶病田间症状

Fig.1SymptomsoftomatoyellowleafcurldiseaseinfieldinHainan

1.1.2主要试剂和仪器设备PremixTaqTM（ExTaqTMVersion2.0plusdye）和DNA片段纯化试剂盒购自宝生物工程（大连）有限公司；DNA滚环扩增试剂盒（IllustraTMTempliPhiTMkit）购自GEHealthcare公司；pGEM-TEASY和pGEM-3Z/5Z载体购自美国Promega公司；T4-DNA连接酶和BamHI等快速限制性内切酶等购自美国NEB公司；琼脂糖凝胶回收试剂盒（GeneJETGelExtractionKit）购自美国Thermo赛默飞公司；植物基因组DNA提取试剂盒（Easy-PurePlantGenomicDNAKit）购自北京全式金生物技术有限公司；大肠杆菌（Escherichiacoli）DH5α感受态细胞购自北京全式金生物技术有限公司；氨苄青霉素、X-gal、蔗糖、琼脂糖和胰蛋白胨均购自生工生物工程（上海）股份有限公司；绿如蓝核酸染料DNAGREEN购自北京天恩泽基因科技有限公司；其他常规分析纯试剂购自广州市芊荟化玻仪器有限公司。T100TMThermalcyclerPCR仪和UniversalHoodⅡ凝胶成像系统均购自美国Bio-Rad公司；电泳仪购自美国E-CApparatusCorporation公司。1.2试验方法

1.2.1植物样品总DNA提取分别取番茄病株、阴性对照和阳性对照叶片各100mg，按照植物DNA提取试剂盒说明书上的步骤进行总DNA抽提，DNA沉淀溶解于50μLddH2O中，于-20℃冰箱保存备用。1.2.2PCR检测利用检测菜豆金色花叶病毒属病毒的通用引物AV494/CoPR（WyattandBrown，1996；何自福等，2004）对采集的15份疑似番茄病样进行PCR检测。反应体系30.0μL：植物总DNA1.0μL（约20ng），ExTaqTMPremix15.0μL，上、下游引物（10μmol/L）各1.0μL，灭菌水12.0μL。反应程序：94℃预变性4min；94℃45s，52℃45s，72℃

45s，进行35个循环；72℃延伸10min。PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳进行检测。1.2.3

基因组全序列扩增

挑选PCR检测为阳性

的代表病样，按照illustraTMTempliPhiTMKit说明书进行RCA扩增：将待测样品总DNA1.0μL（约20ng）与5.0μL样品缓冲液混匀，95℃变性3min；置于冰上冷却；加入5.0μL反应缓冲液和0.2μLDNA聚合酶，30℃恒温下反应18~20h；反应结束后在65℃下加热10min使酶失活，终止反应。RCA扩增产物分别用BamHI进行酶切。反应体系10.0μL：RCA产物2.0μL，BamHI内切酶1.0μL，10×内切酶快速反应缓冲液1.0μL，灭菌水6.0μL。在37℃恒温条件下酶切0.5~2.0h，最后进行电泳分析。1.2.4

基因克隆与序列分析

将RCA产物酶切出

大小约2.7或1.3kb的目的条带进行回收纯化，并连接到用相同内切酶处理后的线性化pGEM-3Z载体上，转化至大肠杆DH5α感受态细胞，从每个平板随机挑取3个阳性单菌落送至生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序。对测序获得的基因序列利用DNAStar的SeqMan进行拼接，然后在GenBank数据库中BLASTn程序进行相似性比对，利用SDT1.2的MUSCLEalignment对序列相似性作进一步比较分析（Muhireetal.，2014），采用MEGA6.0的邻接法（Neighbor-joining，NJ）（Tamuraketal.，2013）构建系统发育进化树，Bootstrapping值设置为1000。

2结果与分析

2.1

PCR检测结果

利用检测菜豆金色花叶病毒属病毒的通用引物AV494/CoPR对采集的15份疑似番茄黄化曲叶病病样进行PCR检测，结果从15份疑似病样的总DNA