T4 DNA连接酶、10×T4 DNA连接酶缓冲液、 载体DNA、外源DNA。
三、操作步骤
1. 外源DNA片段和载体DNA的连接
取1只无菌Ep管、用微量进样器按下列顺序加入各成分。 10×T4 DNA Ligase Buffer 2.5 ul
酶切后的DNA片段 *1 约0.3 pmol
酶切后的载体DNA *2 约0.03pmol
T4 DNA Ligase 1ul
ddH2O 加至 25ul
*1 DNA片段的摩尔数应控制在载体DNA摩尔数的3－10倍。
*2 相同末端的载体与DNA片段进行连接时，应首先将载体进行去磷酸化处理，以防止其自身环化。
2.盖好盖子，用手指轻弹Ep管数次，并于台式离心机离心2s 以集中溶液。
3.将反应管放入16℃过夜反应（12～16h）。
4.取出约25ng的DNA连接液进行琼脂糖凝胶电泳，鉴定连接结果，以未经连接的质粒DNA片段和酶切DNA片段作电泳。
5.用0.1×TE将连接混合物稀释至50ul，使用10～20ul转化大肠杆菌感受态细胞。
四、注意事项
1. 连接产物经鉴定后应迅速做转化实验。
2. 根据具体情况调节酶的用量。平端连接或接头连接都比黏端连接慢得多，而且酶的用量也增大。
3. 单价阳离子或低浓度的聚乙二醇可提高平端连接的效率。
4. 防止载体DNA自身环化，常用碱性磷酸酶处理线性载体，去掉载体的51?C磷酸以抑制DNA片段的自身环化。
41
5. 正确调整载体DNA和外源DNA之间的比例有助于获得高产量的重组产物。
五、相关问题
1. 连接反应的影响因素
除了载体、供体的浓度及其比例等因素外，影响连接反应的因素还有很多，如缓冲液组分、连接温度与时间、酶浓度、DNA浓度及片段末端的碱基序列等。
（1）连接缓冲液的影响
不同的公司提供的连接缓冲液可能有所不同，但大体上都含有以下组分：20-100mmol/L的Tris-HCl，较多用50mmol/L，pH的范围在7.4-7.8，较多用7.8，目的是提供合适酸碱度的连接体系；10mmol/L的MgCl2，作用是激活酶反应；1-20mmol/L的DTT，较多用10mmol/L，作用是维持还原性环境，稳定酶活性，25-50ug/ml的BSA，作用是增加蛋白质的浓度，防止因蛋白浓度过稀而造成酶的失活。与限制酶缓冲液不同的是连接酶缓冲液还含有0.5-4mmol/L的ATP，现多用1mmol/L，是酶反应所必需的。
（2）pH的影响
一般将缓冲液的pH调节到7.4-7.8，较多用7.8。有实验表明，若把pH为7.5-8.0时的酶活力定为100%，那么体系偏碱（pH为8.3）时仅为全部活力的65%；当体系偏酸（PH为6.9）时仅为全部活力的40%。
（3）ATP浓度的影响
连接缓冲液中ATP的浓度在0.5-4mmol/L之间，较多用1mmol/L。研究发现，ATP的最适浓度为0.5-1mmol/L，过浓会抑制反应。例如，5mmol/L的ATP会完全抑制平末端连接，黏端的连接也有10%被抑制；还有报道，当ATP的浓度为0.1mmol/L时，去磷酸载体的自环比例最大。由于ATP极易分解，所以当连接反应失败时，除了DNA与酶的问题外，还应考虑ATP的因素。含有ATP的缓冲液应于-20℃保存，溶化取用后立即放回。连接缓冲液体积较大时最好分小管贮存，防止反复冻融引起ATP分解。与限制酶缓冲液不同的是，含ATP的连接缓冲液长期放置后往往失效，所以也可自行配制不含ATP的缓冲液（可长期保存），临用时加入新配制的ATP母液。
（4）连接温度与时间的影响
因为黏性末端的DNA双链间有氢键的作用，所以温度过高会使氢键不稳定，但连接酶的最适温度又恰为37℃。为了解决这一矛盾，在经过综合考虑后，传统上将连接温度定为16℃，时间为4-16h。现经实验发现，对于一般的黏性末端来说，20℃ 30min就足以取得相当好的连接效果，当然如果时间充裕的话，20℃ 60min能使连接反应进行得更完全一些。对于平末端是不用考虑氢键问题的，可使用较高的温度，使酶活力得到更好的发挥。
（5）酶浓度的影响
42
根据New England Biolabs公司对T4 DNA连接酶的定义，1U的酶可在16℃ 30min内连接20ul体系中Hind Ⅲ酶切片段（黏性末端为0.12umol/L 5,末端，此时DNA质量浓度约为300ng/ul）的50%。日常使用的DNA浓度比酶单位定义状态低10-20倍，连接平末端时酶用量要比连接黏端大10-100倍，厂商为了满足这一要求，又往往提供高浓度的酶（几百个单位/ul），所以进行黏末端连接时需先行稀释。除了立即用于反应的部分可用酶反应缓冲液稀释外，其余都应使用厂商提供的稀释液。稀释液的成分与酶保存缓冲液相同或类似，稀释液中的酶能在长时间保持活力，也便于随时取用。
（6）DNA浓度的影响
尽管有的实验手册上推荐使用0.1-1nmol/L的DNA浓度，但考虑到用质粒作为载体克隆时，最后要求得到环化的有效连接产物，所以DNA浓度不可过高，一般不会超过20nmol/L。相比较而言，以噬菌体、cosmid质粒为载体的克隆过程最后要求线性化的连接产物，所以，DNA的浓度可以高些，至少是接近推荐的浓度。此外，在用大质粒载体进行大片段克隆时，以及在双酶切片段的连接反应中，DNA浓度还应降低，甚至是DNA的总浓度低至几个nmol/L。另据研究，T4 DNA连接酶对DNA末端的表观Km值为1.5nmol/L，所以，连接时DNA浓度不应低于1nmol/L。即应具有2nmol/L的末端浓度。
2. 三种连接酶单位定义
（1）Weiss单位
连接酶单位最早是1968年由Weiss提出的Weiss单位，现也称PPi单位。他的单位定义为：37℃ 20min内将1nmol的32P从焦磷酸根上置换到ATP分子上所需的酶量。现在大多数厂商仍使用这种单位。
（2）d（A-T）环化单位
由于Weiss单位定义中测试的是T4 DNA连接酶中除连接功能外的另一种磷交换功能，并且测试温度高达30℃，与实际连接反应相比无论在哪一方面都有一定的差距，于是，1970年Modrich与Lehman提出了真正度量连接功能的d(A-T)环化单位，又称外切酶抗性检测。d（A-T）环化单位的定义为：30℃ 30min 内将100nmol/L的d（A-T）（约2kb长）转化成抗外切酶的形式。
（3）黏性末端单位
与Weiss单位相比，d（A-T）环化单位更接近实际，但仍有一定的问题，例如，环化单位测试中用的是纯AT片段，与实际连接中4种碱基随机排列不符；再说，如果连接酶将片段连接成多聚体而末环化时，仍可能被外切酶组所切；除此之外，与实际上大多数连接反应使用的温度16℃相比，30℃仍显得偏高。为了衡量实际连接条件下的酶活力，New England Biolabs公司提出了最实用的黏性末端单位，它的单位定义为：16℃ 30min内将5,末端浓度为0.12umol/Lλ-HindⅢ 酶切片段的50%连接上。
43
实验十一 动物组织细胞总RNA的提取
一、实验原理
RNA是基因表达的中间产物，存在于细胞质与核中。对RNA进行操作在分子生物学中占有重要地位。获得高纯度和完整的RNA 是很多分子生物学实验所必需的，如Northern杂交、cDNA合成及体外翻译等实验的成败，在很大程度上取决于RNA的质量。由于细胞内的大部分RNA是以核蛋白复合体的形式存在，所以在提取RNA时要利用高浓度的蛋白质变性剂，迅速破坏细胞结构，使核蛋白与RNA分离，释放出RNA。再通过酚、氯仿等有机溶剂处理、离心，使RNA与其他细胞组分分离，得到纯化的总RNA。在提取的过程中要抑制内源和外源的RNase活性，保护RNA分子不被降解。因此提取必须在无RNase的环境中进行。可使用RNase抑制剂，如DEPC是RNase的强抑制剂，常用来抑制外源RNase活性。提取缓冲液中一般含SDS、酚、氯仿、胍盐等蛋白质变性剂，也能抑制RNase活性。并有助于除去非核酸成分。
本实验介绍异硫氰酸胍法和TRIzol法提取动物组织总RNA并通过电泳 进行鉴定。
二、仪器和试剂
1.仪器：
超净工作台、高速冷冻离心机、电泳仪、紫外分光光度计、凝胶成像系统、振荡器、移液器、吸头、Ep管、玻璃匀浆器、试管、
玻璃器皿洗净后置180℃烘烤8h；不耐高温的器皿（如塑料制品）应用0.1% DEPC浸泡2h,70～80℃烘烤干燥，120℃高压20min，再70～80℃烘烤干燥方可使用。
2.试剂：
(1)细胞裂解液：
异硫氰酸胍 4mol/L
44
柠檬酸钠（pH7.0） 25mmol/L
十二烷基肌氨酸钠 0.5%
β-巯基乙醇 0.1mol/L
称取柠檬酸钠0.64g，十二烷基肌氨酸钠0.415g，吸取β-巯基乙醇0.7ml，用无Rnase的蒸馏水溶解，定容至50ml。然后取以上配制的溶液(CBS液)33ml，异硫氰酸胍 25g,混合，完全溶解后4℃保存备用。
(2)10×凝胶缓冲液：
吗啉代丙璜酸（MOPS）（pH7.0） 200mmol/L
NaAc 100mmol/L
EDTA(pH 8.0) 10mmol/L
过滤除菌后避光保存。
（3）5×变性上样缓冲液：
水饱和的溴酚蓝 16μl
500mmol/LEDTA(pH 8.0) 80μl
甲醛（37%） 720μl
甘油 2ml
甲酰胺 3084μl
10×凝胶缓冲液 4ml
加无RNase水至10ml，4℃可保存3个月。
（4）TRIzol RNA抽提试剂
（5）2mol醋酸钠
（6）0.1% DEPC
(7)平衡酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）
45
分子生物学实验室常用仪器及使用方法
