实验七 DNA的定量
一、 实验原理
核酸分子（DNA或RNA）由于含有嘌吟环和嘧啶环的共轭双键，在260 nm波长处有特异的紫外吸收峰，其吸收强度与核酸的浓度成正比，这个物理特性为测定核酸溶液浓度提供了基础。
1 OD260相当于dsDNA 50 ug/ml，ssDNA 33 ug/ml和ssRNA 40 ug/ml。可以此来计算核酸样品的浓度。
紫外分光光度法不但能确定核酸的浓度，还可通过测定260nm和280nm的紫外线吸收值的比值（A260/A280）估计核酸的纯度，纯的DNA制品的比值为1.8，RNA的比值为2.0, 若DNA高于1.8,则可能有RNA污染，低于1.8则有蛋白质污染。
对于很稀的核酸溶液，可用荧光光度法进行测定。DNA 本身并不产生荧光，但在荧光染料溴化乙锭（EB）插入DNA 的碱基对平面之间并与之结合后，DNA样品能在紫外光的激发下产生桔红色荧光。荧光强度与被结合的EB的量成正比，而被结合的EB的量又与核酸分子长度和含量成正比，使用一系列已知的不同浓度DNA溶液作标准对照，可比较出被测DNA溶液的浓度。灵敏度可达1～5ng。由于是基于目测，所以是估计水平。 该方法经济简便，但准确性较低。
二、仪器及试剂
1. 仪器：Amersham GeneQantTM Pro 紫外可见分光光度仪，琼脂糖凝胶电泳设备。
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2. 试剂及配制：
5×上样缓冲液：
配制10 ml
0.5 mol/L EDTA(pH8.0) 2 ml
10% SDS 50 ul
50% 甘油 2.5 ml
0.2% 溴酚蓝 10 mg
0.2% 二甲苯青FF 10 mg
加去离子水至10 ml
其它试剂：0.1×TE 、DNA标准液，EB储存液（10 mg/ml），
三、实验步骤
1.紫外分光光度法
（1）用0.1×TE对待测DNA样品按1:20或合适的倍数稀释。
（2）开机，仪器会自动对光路及分析软件进行检测，待显示屏上出现“instrument Ready”时，进入核酸测定窗口
（3）调零。先用0.1×TE缓冲液注入样品杯，放入样品槽，关闭盖板。点击“set ref”键，仪器自动校正零点。将样品槽内的样品杯取出，换上待测样品。
（4）吸70 ul已稀释的DNA样品转入石英样品杯，放入样品槽，关闭盖板。如果样品很少，可以用5～7ul的石英样品杯。点击“enter” 键，仪器即进入分析状态。窗口同时显示260和280nm处的光密度（OD值）及260/280nm和280/260nm的比率以及DNA样品的浓度等。
（5）打开盖板，取出石英样品杯，吸出样液，用高纯水清洁石英样品杯，风干后，再加入下一个待测样品。
（6）DNA纯度：以OD260/ OD280比值来反映。当OD60 /OD80比值 <1.8时，说明样品存在蛋白质或酚等杂质，可采用平衡酚/氯仿―异戊醇再抽提除去蛋白质或用乙醚抽提去除残留酚，再用无水乙醇沉淀，TE悬浮后再测定。当OD60/OD280比值>2.0，说明样品存在RNA污染，可以用RNA酶处理样品去处RNA。
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2. EB荧光分析法
（1）琼脂糖凝胶的制备。
（2）样品的准备。把待测DNA样品进行1:2连续稀释，并准备一份DNA标准液作对照。
（3）上样。稀释样品与上样缓冲液按1:5混合均匀后上样。
（4）电泳。用100V稳压电泳至溴酚蓝指示剂迁移到凝胶的3/4处停止电泳。
（5）取出凝胶，入EB荧光染液中作用20min，取出后清水漂洗干净，然后紫外检测。肉眼可见到的最高稀释度约含DNA 80ng。此法也可用于了解核酸样品中的严重污染干扰核酸紫外线吸收物质的情况。
四、常见问题
1． 紫外分光光度法不能区分DNA分子的构型，如质粒DNA分子的超螺旋、开环、线状三种构型，也不能区分染色体DNA和RNA等。由于测定吸收光度A260时，难以排除RNA、染色体DNA、以及DNA解链的增色效应等因素的影响，因此测得的数据往往比实际浓度偏高。
2．OD320值是背景，若溶液盐浓度越高，OD320也越高。
3．测样品时使用的石英样品杯比较贵，要小心不要摔破，持杯时也不要接触透明的光面以避免干扰测定。
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实验八 PCR基因扩增
一、实验原理
聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）是一种体外核酸扩增系统，其原理类似DNA分子的天然复制过程，是将在待扩增的DNA片段和与其两侧互补的两个寡聚核苷酸引物，经变性、退火和延伸若干个循环后，DNA扩增 2n 倍。该技术已成为分子生物学中一种有助于DNA克隆及基因分析的必需工具。
PCR的工作程序实际上是一个在模板DNA、一对已知序列的寡核苷酸引物和四种脱氧核苷酸等存在的情况下，DNA聚合酶依赖的酶促合成反应。扩增的特异性取决于引物与模板DNA的结合。整个扩增过程分三步：①变性，加热使模板DNA双链间的氢键断裂而形成两条单链；②退火，突然降低温度后模板DNA引物按碱基配对原则互补结合，也存在两条模板链之间的结合，但由于引物的高浓度、结构简单等特点，主要的结合发生在引物与模板之间；③延伸，在DNA聚合酶及镁离子等的存在条件下，从引物的 3 ′端开始，结合单核苷酸，形成与模板链互补的新的DNA链。完成以上三步为一个循环，每经过一个循环，样本中的DNA量就增加一倍，新形成的DNA链又成为下一轮循环的模板。经过25～40个循环后，DNA 可扩增106～109倍。 现用图示说明PCR原理:
二、仪器及试剂
1.仪器：PCR仪、台式离心机、移液器及吸头、PCR薄壁管、电泳仪等
2.试剂：
10X PCR 缓冲液配制（部分随Taq酶提供）：
250～500 mmol/L KCl
100～500 mmol/L Tris-Cl（pH8.4）
15～20 mmol/L MgCl2
0.5% Tween-20
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1mg/L BSA
其它试剂：模板DNA、dNTP 混合液、Taq聚合酶、上游和下游寡核苷酸引物、琼脂糖凝胶、等
三、操作步骤
1. PCR 体系（40ul）：
4ul 10XPCR 缓冲液
4ul 25mM MgCl2（根据不同公司PCR 缓冲液的不同而定）
Xul 模板DNA ≥50ng
1ul 上游引物（50-100ng）
1ul 下游引物（50-100ng）
1ul dNTP Mixture（终浓度20－200uM）
0.4 ul Taq聚合酶
加ddH2O至40ul
视PCR仪有无热盖，不加或添加石蜡油。
2. 将上述试剂依次加入PCR薄壁管。加样后用手轻弹混匀，6000 rpm离心15 sec使反应成分集于管底。
3. PCR反应热循环程序设置：
（1） 95℃ 300s 变性
（2） 94℃ 45s 变性
（3） 55℃ 45s 退火（根据不同引物可能有不同退火温度）
（4） 72℃ 45s 延伸（每分钟可延伸1kp）
重复步骤2-4共 30 循环
（5） 72℃ 600s 延伸
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分子生物学实验室常用仪器及使用方法
