（8）平衡酚、氯仿
（9）无水乙醇、70%乙醇、异丙醇
(10)无RNase水
三、操作步骤
（一）异硫氰酸胍法（PLT）
1.取新鲜动物组织0.1～0.2g置于组织匀浆器中，加入预冷的细胞裂解液1ml,在冰浴中迅速匀浆15～30s，以充分研碎组织。然后将细胞悬浮液吸入另一试管中。
2.加入2mol醋酸钠（pH4.0）120μl，充分混匀。
3.加入1.2ml酚：氯仿：异戊醇，充分混匀摇振10s，冰浴15min。
4.将混合物转移至1.5ml Ep管中，4℃，离心10 000r/min,20min.
5.移取上层水相至另一Ep管中，加入等体积的异丙醇，静置?C20℃，30min沉淀RNA.
6. 4℃，离心12 000r/min，15min.
7. 弃上清液，加入70%乙醇400μl,洗涤RNA沉淀物；如果RNA沉淀物被悬浮，则4℃离心10 000r/min，10min。
8. 弃上清液，自然干燥，但应避免沉淀完全干燥，否则RNA难以溶解。
9.加入100μl无RNase水重悬RNA，或加1ml无水乙醇和1/10体积3mol醋酸钠（pH4.0），?C70℃保存。
（二）TRIzol试剂提取RNA
1.取新鲜动物组织0.1～0.2g置于组织匀浆器中，加入预冷的Trizol液 1ml 于玻璃匀浆器中，在冰浴中迅速匀浆15～30s，以充分研碎组织。然后将细胞悬浮液吸入另一1.5ml Ep管中，于室温下静置5min。
2.加入200μl氯仿，剧烈振摇15s混匀后，室温静置3min。
3. 4℃，10 000r/min离心15min，RNA分布于水相中。
4.将上层无色水相转移到另一Ep管中，加入500μl 异丙醇，室温静置10min。
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5.4℃，10 000r/min离心10min。
6.弃上清液，用1ml 75%乙醇洗涤RNA沉淀物，4℃，7500r/min离心5min。
7.弃上清液，室温干燥15min.
8.向干燥过的沉淀物中加入200μl DEPC处理水（无核水）溶解沉淀物，于-20℃保存备用。
（三）RNA检测
1.在紫外分光光度计上检测RNA浓度及纯度。
方法同实验四，用DEPC处理水校正零点；用DEPC处理水稀释RNA样品；读取OD260、OD280值及OD260/OD280的比值。
2. 琼脂糖凝胶甲醛变性电泳检测
（1）制备凝胶（1.2%）。称1.2g琼脂糖，加72ml DEPC处理水，加热熔化。冷却至60℃，在通风橱内加入10×凝胶缓冲液10ml，甲醛（37%）18ml，混匀后，倒胶。
（2）制备样品。在离心管中，将RNA样品与5×变性上样缓冲液以4：1混匀。65℃温育5～10min，迅速在冰上冷却5min，离心数秒。
（3）上样前凝胶须预电泳5min，随后将样品卷入上样孔。以5V/cm的电压电泳1.5～2h.。
（4）待溴酚蓝迁移至凝胶长度的2/3～4/5处结束电泳。将凝胶置于溴化乙啶溶液（0.5μg/ml，用0.1mol/L乙酸胺配制）中染色约30min。
（5）在凝胶成像系统观察并分析。
四、注意事项
1.RNA是极易降解的核酸分子。因此提取总RNA必须在无RNase 环境中，戴口罩、手套、使用无RNase污染的试剂、材料、容器。
2.所有溶液应加DEPC至0.05%～0.1%，室温处理过夜，然后高压处理或加热至70℃ 1 小时或60℃过夜，以除去石油残留的DEPC。
3.所用的化学试剂应为新包装，称量时使用干烤处理的称量勺，所有操作均应在冰浴中进行，低温条件可减低RNA酶活性。
4.根据RNA样品的紫外吸收OD值，可计算出RNAd 浓度。
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单链RNA [ssRNA]=40×（OD260-OD310）×稀释倍数
纯RNA OD260 / OD280比值通常在1.7～2.0。若比值低于1.7,说明有蛋白质等污染，应用酚/氯仿在抽提。若比值低于2.0,表明有盐、胍、糖可用LiCL选择沉淀RNA以除去杂质。
5.RNA样品电泳后，可见28S、18S及5S小分子RNA条带，则说明完整性好。若有降解可能是操作不当或污染了RNase.。28S和18S RNA比值约为2：1,表明RNA无降解。如比值逆转，则表明RNA降解。电泳中如果在28S 后方还有条带，表明有DNA污染，应用DNase处理后再进行纯化。
主要参考书：
1..金冬雁等译.分子克隆实验指南. 第二版.北京：科学出版社，1995
2.子颖等译.精编分子生物学实验指南. 科学出版，
3.周俊宜编.分子生物学基本技能和策略. 科学出版社
4.姜泊等编.分子生物学常用实验方法.北京：人民军医出版社，1996.
5.刘进元等编.分子生物学实验指导.北京：清华大学出版社，2002.
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分子生物学实验室常用仪器及使用方法
