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病原菌的分离鉴定
篇一:常见病原菌采样分离过程 金黄色葡萄球菌采样分离过程 1、样本采集及初步分离 (1)奶样的采集:
采集有乳房炎和隐形乳房炎症状较明显的奶牛,消毒挤奶人手、奶牛乳头,弃2-3把乳,以乳样收集管无菌收集每个乳区乳样10-30mL,编好编号,4个乳区按:左前LF、左后Lh、右前RF、右后Rh编号,采集后尽快返回实验室,如不能尽快返回,应放在低温环境中带回。 (2)乳房皮肤拭子
用0.5mL肉汤润湿的消毒棉球拭子从乳房皮肤檫拭到乳头顶端,如果乳房土较多的话先檫掉土。拭子放入5mL离心管中,再放入冰盒中,迅速带回实验室处理。 (3)鼻腔拭子
用消毒棉球拭子插入动物鼻腔中,取出后放到盛有0.5mL肉汤的5mL离心管中,放入冰盒中,迅速带回实验室
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处理。
菌种的初步分离
首次分离时,用接种环蘸取样品在科玛嘉金黄色葡萄球菌显色平板上涂布接种,37℃,16-18小时培养后,从显色平板上挑取红色的单菌落,用脑心浸液(bhI)肉汤35℃培养18小时左右。
需要注意的是金葡菌初次分离时,接种显色培养基后培养时间最好不超过18h进行观察,因为超过24h后所有的葡萄球菌属细菌皆会导致显色培养基变色,进而出现假阳性。 2、菌种的保存
2mL灭菌离心管中加入400μL新鲜菌液+200μL60%灭菌甘油,-80℃(长期)或-20℃(临时)冻存。 3、菌种的复苏
如需再次纯化,或进行进一步实验,可将甘油保种的菌液在显色平板或哥伦比亚血琼脂平板上划线培养,或者将保种的菌液直接接入液体培养基培养。 肠球菌采样分离过程 1、样本采集及初步分离 (1)肛门拭子
以灭菌长棉签采集猪肛门拭子或蘸取新鲜粪便,棉拭子应以捻转方式插入肛门4-5厘米深,取出后放入1mL营养肉汤的灭菌离心管中,如不能立即接种,应放于低温环境中迅
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速带回实验室处理。 (2)泄殖腔拭子
以灭菌短棉签采集鸡泄殖腔拭子或采集一段盲肠后蘸取新鲜粪便,棉拭子应以捻转方式插入泄殖腔2-3厘米深,取出后放入1mL营养肉汤的灭菌离心管中,如不能立即接种,应放于低温环境中迅速带回实验室处理。
首次分离时,将样品在6.5%nacl营养肉汤中,45℃,18-24小时预增菌进行选择性培养后,将上述培养物以划线方式接种在肠球菌选择性培养基(叠氮钠-结晶紫-七叶苷培养基,beA)上,37℃,培养18-24小时,从选择性培养基上挑取灰色,半透明,1-2mm大小的单菌落,用脑心浸液(bhI)肉汤37℃培养18小时左右。 2、菌种的保存
2mL灭菌离心管中加入400μL新鲜菌液+200μL60%灭菌甘油,-80℃(长期)或-20℃(临时)冻存。 3、菌种的复苏
如需再次纯化,或进行进一步实验,可将甘油保种的菌液在beA琼脂平板上划线培养,或者将保种的菌液直接接入液体培养基培养。
需要注意的是由于beA琼脂颜色的变化导致假阳性的发生,因此,可以将肠球菌疑似菌株在beA琼脂上进行二次筛选,提高分离准确率。
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大肠杆菌采样分离过程 1、样本采集及初步分离 (1)肛门拭子
以灭菌长棉签采集猪肛门拭子或蘸取新鲜粪便,棉拭子应以捻转方式插入肛门4-5厘米深,取出后放入1mL营养肉汤的灭菌离心管中,如不能立即接种,应放于低温环境中迅速带回实验室处理。 (2)泄殖腔拭子
以灭菌短棉签采集鸡泄殖腔拭子或采集一段盲肠后蘸取新鲜粪便,棉拭子应以捻转方式插入泄殖腔2-3厘米深,取出后放入1mL营养肉汤的灭菌离心管中,如不能立即接种,应放于低温环境中迅速带回实验室处理。
首次分离时,用接种环蘸取样品在科玛嘉大肠杆菌显色平板上涂布接种,37℃,16-18小时培养后,从显色平板上挑取蓝色的单菌落,用营养肉汤37℃培养18小时左右。 2、菌种的保存
2mL灭菌离心管中加入400μL新鲜菌液+200μL60%灭菌甘油,-80℃(长期)或-20℃(临时)冻存。 3、菌种的复苏
如需再次纯化,或进行进一步实验,可将甘油保种的菌液在琼脂平板上划线培养,或者将保种的菌液直接接入液体培养基培养。
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沙门氏菌采样分离过程 1、样本采集及初步分离 (1)肛门拭子
以灭菌长棉签采集猪肛门拭子或蘸取新鲜粪便,棉拭子应以捻转方式插入肛门4-5厘米深,取出后放入1mL营养肉汤的灭菌离心管中,如不能立即接种,应放于低温环境中迅速带回实验室处理。 (2)泄殖腔拭子
以灭菌短棉签采集鸡泄殖腔拭子或采集一段盲肠后蘸取新鲜粪便,棉拭子应以捻转方式插入泄殖腔2-3厘米深,取出后放入1mL营养肉汤的灭菌离心管中,如不能立即接种,应放于低温环境中迅速带回实验室处理。
需要注意的是成年动物沙门氏菌携带率非常低,因此对于沙门氏菌的采集应以弱雏为主要分离对象来提高分离率。 首次分离时,将样品在sc肉汤(亚硒酸盐-半胱氨酸肉汤)中,37℃,18-24小时预增菌进行选择性培养后,将上述培养物以划线方式接种在沙门氏菌选择性培养基上,37℃,培养18-24小时,从选择性培养基上挑取紫色的单菌落,用脑心浸液(bhI)肉汤37℃培养18小时左右。 2、菌种的保存
2mL灭菌离心管中加入400μL新鲜菌液+200μL60%灭菌甘油,-80℃(长期)或-20℃(临时)冻存。
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