第七章、微生物的遗传和变异 一、名词解释:
1、饰变:指外表的修饰性改变,即不涉及遗传物质结构改变而只发生在转录、翻译水平。 2、基因:是生物体遗传信息的基本组成单位,是一段直线排列的核苷酸序列,具有编码rna、蛋白质的功能。
3、质粒:独立于染色体外,能进行自主复制的小型共价闭合环状的dsDNA分子。 4、转座因子:细胞中位于染色体或质粒上能改变自身位置的一段DNA序列。
5基因突变:一个基因内部遗传结构或DNA序列的任何改变,包括一对或少数几对碱基对的缺失插入或置换而导致的遗传变化,又称点突变,是狭义的突变。
6、诱变育种:利用诱变剂,提高随机突变频率,通过一定筛选方法获得所需高产优质菌株。 7、完全缺陷噬菌体:噬菌体装配时出现偶然错误,将宿主细胞DNA装入,不含本身的DNA 部分缺陷噬菌体:噬菌体因不正常切割,脱下的DNA仅一部分为噬菌体DNA,另一部分为宿主DNA
8、营养缺陷型菌株:野生菌发生基因突变而丧失合成一种或几种生长因子、或其他必须营养物的能力,因而无法在Mm培养基上正常生长繁殖的突变类型。
9、基因工程:是指对遗传信息的分子施工,即把分离到的合成的基因经过改造插入到载体中,然后导入宿主细胞内使其扩增和表达,从而获得大量基因产物或改变生物性状。
? 基因探针:是一段带有检测标记,且序列已知的能与目标基因互补结合的单链DNA或
RNA片段。
10、操纵子:是原核生物特有的,由操纵区同一个或几个基因联合起来,形成的一个在结构功能上协同作用的整体。由调节基因、启动子、操纵区、结构基因构成。
11、葡萄糖效应:当环境中有多种能源物质时,微生物首先利用更易分解利用的能源物质(糖),而首先被利用的物质的分解对利用其他物质的酶的产生有抑制作用。(抑制酶的产生)
二、填空及大题
1、⑴格里菲斯,肺炎双球菌转化实验:发现转化现象,几年后他人提出转化因子。 之后的补充实验证明DNA是遗传物质,pr不是。
⑵噬菌体感染实验:P32标记DNA、S35标记蛋白质外壳。证明DNA是,但不知pr不是。 ⑶植物病毒重建实验:苯酚溶液震荡处理,使rna、pr分离,分别感染烟草花叶。证明rna才是遗传物质。
2、微生物作为遗传学研究模式生物的优点:
①物种与代谢类型多样性;②营养体一般是单倍体,且个体结构简单;③繁殖速度快,易于在培养基大量繁殖;④易于积累不同代谢物或代谢产物;⑤环境对群体中个体的作用的直接性和均一性;⑥易于形成营养缺陷型和抗药性突变株;⑦存在特色的原始有性生殖方式。
3、微生物自发突变的主要原因是?(07填空,08.10.11.13.15.17大题)(P206)
①背景辐射和环境因素引起;②微生物自身有害代谢物引起;③DNA复制过程碱基配对错误引起(碱基能以互变异构体的不同形式存在);④转座因子的插入和缺失。
? 微生物基因突变的特性有?(09,12、14填空17大题)(P200)
①自发性——自发产生各种遗传性状突变;②不对应性——突变性状与引起突变的原因无直接对应关系;③稀有性——低概率;④独立性——某基因的突变不受其他基因的影
响;⑤可诱变性——诱变剂可提高突变率;⑥稳定性——突变后的新性状是稳定可遗传的;⑦可逆性——回复突变。
? 了解自发突变原因和特性对实际工作的指导意义(17.13 P231)
⑴防止菌株衰退:由于个别个体发生突变,若不采取有效措施一味移种传代,则群体中负变个体比例增大,导致物种性状衰退。 为防止菌株衰退(15大题):①控制传代次数;②创造良好培养条件;③利用不易衰退细胞接种(孢子);④有效的保藏方法,冷冻干燥等。 ⑵菌株的复状:途径(14填空):①纯种分离法;②通过宿主体内复状;③淘汰已衰退个体。
⑶菌种的保藏:原则:目标菌种不死亡、不退化、不生长、不被污染。
09填空P233)目的:目标菌种不死亡、不退化、不生长、不被污染,已达到研究交换和使用的目的。
方法:①选典型菌种,优良菌种,保藏其分生孢子、芽孢等休眠体; ②创造有利于保藏的环境条件(06.07填空):低温、干燥、黑暗、无氧、缺养料、加保护剂。 ? 可证明基因突变自发性的典型实验有?(08填空)(P200)
⑴Luria 等的变量实验;⑵Newcombe的涂布实验;⑶Ledgerberg等的影印平板实验。 4、诱发突变常用诱变剂、机理:(5-溴尿嘧啶和亚硝酸的区别16简答)
⑴碱基类似物:①5-溴尿嘧啶——以T形式掺入,偶与G误配,使AT→GC;②2-氨基嘌呤——以A形式掺入,偶与C误配,使AT→GC。
⑵插入燃料:丫啶橙喝溴化乙锭——插入DNA碱基对之间,使其分开,导致DNA复制使滑动,一小段DNA的插入和缺失。
⑶与DNA发生化学反应的诱变剂:①HNO2 ——使A和C发生脱氨反应,氨基变酮基,使AT→GC,GC→AT;②NH2OH(羟胺)——与C反应,使GC→AT;
③烷化剂:a.甲磺酸乙酯EMS——G上加甲基,与T误配,使GC→AT; b.亚硝基胍NTG(诱变作用超级强)——多位点突变。
⑷辐射和热:①UV——相邻胸腺嘧啶形成二聚体,使修复时导致错误和缺失。
②电离辐射——形成自由基。电离辐射比UV穿透力强,能到达生殖细胞,常用于动植物诱变育种;
③热——使C脱氨基成为U,使GC→AT。
⑸生物诱变因子:转座因子——可随机插入基因组。
? 诱变育种几个原则:8(17 P209)
⑴微生物自身:①选择适宜原始菌株;②处理要求:单核细胞/单孢子悬浮液;③寻找菌株形态与生化特性相关性;
⑵方案、方法:①设计高效筛选方案;②创造新型高效筛选方法。 ⑶诱变剂:①选择简单高效诱变剂;②选用最适诱变剂量;③采用多种诱变剂协同作用。
? 说明筛选营养缺陷型突变株的一般步骤和方法?及营养缺陷型微生物的应用
(04,05,06,08,09,12,14,17大题P215) *筛选步骤和方法原理:
⑴诱变处理:紫外线处理最为方便。——原理:UV使DNA中相邻胸腺嘧啶形成二聚体,在修复时会发生DNA序列缺失和错误,获得突变。 ⑵淘汰野生型:
①抗生素法:a.青霉素法——抑制细菌细胞壁肽聚糖形成,杀死正常繁殖的野生型,而无法杀死处于休眠状态的营养缺陷型;
b.制霉素法——与真菌细胞膜上甾醇作用,杀死处于生长状态的野生型霉菌酵母菌。 ②菌丝过滤法:适用于进行丝状生长的真菌和放线菌。 原理:基本培养基中野生型菌发芽,长成菌丝,而营养缺陷型孢子这不能。因此将诱变处理后的孢子在Mm培养基培养一段时间,再用擦镜纸过滤数次即可。 ⑶检出缺陷型:夹层培养法、影印平板法。
eg:影印平板法:诱变处理后细胞涂布在一完全培养基上,经培养后长出菌落,用影印培养工具将平板上全部菌落转移至另一Mm培养基上,培养后比较两个平板菌落,若前一培养基有菌落而后一平板相应位置为空白,说明这就是一营养突变株。
⑷鉴定缺陷型:生长谱法:在有供试菌的基本培养基表面添加营养物,在某营养物周围是否长菌来判断该菌的营养要求(即该营养物的缺陷型突变住)
? 营养缺陷型的应用:
⑴科学实验中:①可作为研究代谢途径和杂交(包括准性杂、交细菌接合、细胞融合)、转化、转导、转座等遗传规律所不可缺少的遗传标记菌种; ②可作为Aa、维生素、碱基等物质的生物测定实验菌种;
⑵生产实践中:①可直接用作发酵工业生产Aa等代谢产物的菌种;
②也可用作对生产菌种进行育种时时所不可缺少的亲本遗传标志和杂交种的选择性标记。
5、DNA损伤的修复:**DNA聚合酶除5'→3'的复制功能外,还有3'→5'的纠错功能。 ⑴光复活作用:光解酶利用光能将二聚体拆开; ⑵切除修复(暗修复):内切酶切除损伤部位,DNA聚合酶和连接酶修复单链缺口。(*主要修复系统,可修复大多数DNA损伤,除 碱基错配和单核苷酸插入);
⑶重组修复:不除去亲链的损失部位,复制后交换损失部位,使子链没有损伤;
⑷SOS修复:菌受到DNA收到大范围重大损伤时的应急反应,修复基因切除大的损伤部分。
6、原核微生物的基因重组(P217) ? 特点(05):①片断性:仅一小段DNA序列参与重组;②单向性:即供体菌向受体菌做
单方向转移;③多样性:转移机制独特而多样,接合、转化、转导、原生质体融合。 ? 途径(05、07):
⑴接合:供体菌通过性菌毛和受体菌直接接触而产生遗传信息的转移和重组。
F+——雄性菌株,有F质粒;F-——雌性菌株,无F质粒;Hfr——F质粒插入到染色体DNA中形成高频重组菌株;F'——Hfr不正常脱离产生的有宿主染色体基因的F质粒。 ⑵转导:通过缺陷噬菌体将DNA从供体菌传到受体菌。
①普遍性转导:通过完全缺陷噬菌体,可转导染色体任何部分到受体细胞中。 a.完全转导:供体细胞DNA被整合到受体细胞染色体上;
b.流产转导:未被整合到受体细胞染色体上,但可以转录、翻译和表达。
②局限性转导:通过部分缺陷噬菌体,将供体细胞中特定基因导入受体细胞。 a.低频转导:只产生少量转导子;
b.高频转导:产生大量转导子。
⑶转化:是指同源或异源游离DNA分子(质粒和染色体DNA)被自然或人工的感受态细胞摄取,并得到表达的水平方向的基因转移过程。
*转化的条件:①供体菌与受体菌有亲缘关系;②游离DNA片段必须为双链DNA片段;③受体细胞必须处在特定生理状态——感受态(经CaCl或电穿孔处理)。 ⑷原生质体融合(11大题):
①高渗溶液中去壁:溶菌酶——细菌放线菌细胞壁;蜗牛消化酶——真菌细胞壁; ②促融:聚乙二醇PEG或电脉冲处理; ③等渗溶液稀释,涂在Mm培养基;
④形成菌落后用影印平板法,接种到选择培养基,检出融合子; ⑤筛选优良性状的融合子。
? ******真核微生物:
①有性杂交:不同性孢子间发生接合作用,随之进行染色体重组。 ②准性杂交:不同个体体细胞间原生质体融合。不经减数分裂就能导致基因重组的过程。 ③转化;④原生质体融合。
7、阐述微生物与基因工程的关系(应用)?(09大题,见笔记、蓝P251)
①基因资源;②基因工程载体;③基因工程工具酶来源;④基因克隆的宿主;⑤基因表达的生物反应器;⑥基因结构和功能理论研究基础。
8、简述基因工程的基本操作过程?(07大题)(P228)、步骤和方法(05) ⑴目的基因的获取:
途径:①从适当供体生物(微生物、植物、动物)中提取;②从cDNA文库分离;③化学合成法。
⑵制备重组DNA(外源基因与载体的体外连接): 方法——用限制性核酸内切酶切外源基因和载体,形成互补的黏性末端 → 连接酶使二者共价结合。
⑶重组DNA导入宿主细胞:
①质粒载体:转化法——CaCl2处理宿主成为感受态;②噬菌体:感染法;③DNA片段——基因枪法和花粉管同道法。
⑷目的基因克隆体的分离与鉴定:
方法:①筛选;利用载体的选择性标记——抗药性插入失活、β-半乳糖苷酶显色反应等; ②鉴定:利用插入基因的表型(新性状);③核酸杂交。
⑸外源基因在宿主细胞表达:控制条件,使目的基因高效表达,产生所需产品或新的性状。
? 基因工程优良载体要求、条件:①相对分子质量较小,具有自我复制能力的复制子;②
能在载体中大量扩增;③有若干核酸内切酶的单一切点,使目的基因整合到一定位置;④必须有选择性标记,以便筛选;⑤具有一定安全性,胞内不转移,胞外不扩散。
? 质粒作为克隆载体的有利特性:①相对分子质量小,便于分离操作;②呈环状,分离过
程保持性状稳定;③有独立复制起点;④拷贝数多,可使外源基因很快复制;⑤存在抗药基因等选择标记,便于重组质粒的筛选和鉴定;⑥含有多种限制酶的单一识别位点;
? 对克隆载体宿主要求:①能形成感受态,高效吸收外源DNA;②不具有限制修饰系统,
防止外源DNA被降解;③应为重组缺陷型菌株,即外源DNA与染色体DNA不发生同源重组;④要具有安全性;⑤要根据载体类型及选择标记等选择合适宿主。 9、基因工程应用:①生产多肽类药物、疫苗等——激素、酶、激活剂抑制剂、抗体、疫苗。 ②基因治疗:是指利用基因操作纠正或补偿基因的缺陷; ③转基因动植物:特性的基因改良; ④改造传统工业发酵菌种;
⑤环境保护:培育能同时分解多种有毒有害物质的“超级菌”。
10、说明原核微生物基因转录的操纵子调控机制?(09大题)(P193、蓝书P232) 操纵子调控是转录水平的调控。
*调控机制可分为:正转录调控和负转录调控。
⑴负转录调控:调节基因产生阻遏蛋白,当于操纵区结合时,阻碍结构基因的转录。
①当阻遏蛋白和环境中的诱导物接合时,会改变阻遏蛋白空间构象,不能不操纵区接合,使得结构基因得以转录——称负控诱导系统。
*以大肠杆菌乳糖操纵子为例,说明转录水平基因表达调控机理(16、17)
(eg:大肠杆菌lac1与乳糖操纵子作用——调节基因产生阻遏蛋白,其结合于操纵区使结构基因不能转录,而当环境中存在诱导物(乳糖或乳糖类似物)时,乳糖能在β-半乳糖苷酶作用下发生分子重排,变为异乳糖,异乳糖作为诱导物结合阻遏蛋白,改变空间构象而和操纵区结合,使得RNA聚合酶能顺利转录结构基因,形成mRNA,并翻译。)
②当阻遏蛋白和环境中的辅阻遏物结合,会改变阻遏蛋白空间构象,使其与操纵区结合,阻止结构基因的转录——称负控阻遏系统。 (eg:大肠杆菌色氨酸操纵子;)
⑵正转录调控:调节基因产生激活蛋白,于操纵区结合时,才能使结构基因转录。
①正控诱导系统——环境中诱导物的存在时,结合激活蛋白,使其处于激活状态,促进RNA聚合酶转录结构基因。
②正控阻遏系统——环境中有阻遏物存在时,结合激活蛋白,使其处于不活动状态,不能促进RNA聚合酶转录结构基因。
? 代谢调节类型之一——酶合成调节(量的调节)
⑴转录水平调节:①操纵子的转录调节;②分解代谢物阻遏调节(葡萄糖效应);③细菌应急反应——空载tRNA;通过σ因子更换调控。
⑵转录后调控:①稀有密码子和重叠基因调控;②mRNA稳定性(功能性半衰期);③反义RNA调控。
第7章、微生物的遗传和变异
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