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EB病毒（EBV）核酸检测标准操作规程
（荧光PCR法）
1.目的
规范EB病毒核酸DNA（荧光PCR法）检测操作流程，准确进行EB病毒DNA分析。 2.应用范围
使用中山大学达安基因股份有限公司EB病毒核酸扩增(PCR)荧光定量检测试剂盒（荧光PCR法）和Mx3000P荧光定量PCR仪、Roche480荧光定量PCR仪进行EB病毒DNA检测。 3.职责
由PCR实验室制定程序文件，专业技术人员负责执行，实验室主管负责监督实施。 4.内容
4.1 实验原理及其临床应用
本试剂盒用一对EB病毒（EBV）特异性引物和一条EB病毒（EBV）特异性荧光探针，配以PCR反应液、耐热DNA聚合酶(Taq酶)、核苷酸单体（dNTPs）等成分，用PCR体外扩增法检测EB病毒（EBV）DNA。用于人血中EB病毒DNA的测定，为临床提供参考， 4.2 标本采集
4.2.1 使用标本类型：全血。
4.2.2 标本采集；由合作单位按照以下要求进行采集。
4.2.2.1全血：用一次性无菌注射器抽取受检者静脉血2毫升，注入EDTA(乙二胺四乙酸二钠)或枸橼酸钠抗凝剂的玻璃管，立即轻轻颠倒玻璃管混合5-10次，使抗凝剂与静脉血充分混匀，密闭送检。
4.2.3 标本保存和运送：标本可立即用于测试，也可以保存于-20℃待测，保存期为6个月。标本运送采用0℃冰壶。 4.3 试剂准备
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4.3.1 供应商：中山大学达安基因股份有限公司。
4.3.2 此实验试剂应放在冰箱-20℃保存，在实验前5分钟取出备用，实验后应立即放回冰箱-20℃。
4.3.3 如果试剂出现了封口蜡破损导致液体外漏以及过期试剂，应及时更换。 4.4 质控品
4.4.1 质控品来源：随试剂盒，由厂家提供。 4.4.2 质控品保存条件：置于-20℃冰箱中保存。 4.4.3 质控频度：每次实验均需做质控。 4.5 操作过程说明 4.5.1 DNA提取
4.5.1.1 质控品处理：取出阴性质控品、临界阳性质控品、强阳性质控品。8000rpm离心
数秒，吸50ul至0.5ml灭菌离心管中，加入50ulDNA提取液充分混匀，100℃恒温处理10±1分钟；12000 rpm离心5分钟，备用。
4.5.1.2 样本处理
4.5.1.2.1 取全血500ul至干燥玻璃试管中，加入生理盐水500ul轻摇混匀； 4.5.1.2.2 取干燥玻璃试管加入1ml淋巴细胞分离液；
4.5.1.2.3 将稀释好的全血用移液器缓慢加入加有淋巴细胞分离液的试管中(注意沿着管壁，速度要慢)；
4.5.1.2.4 2000rpm离心20分钟（建议用水平离心机）；
4.5.1.2.5 吸取白细胞层(从上往下第二层)，加入1.5ml离心管，12000rpm离心5分钟； 4.5.1.2.6 去上清，沉淀中加入50ulDNA提取液充分混匀，100℃恒温处理10±1分钟；
12000rpm离心5分钟，上清备用。
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4.5.2.1 加样：取PCR反应管若干，加入处理后的样品（标本、阴性质控品、临界或强阳性
质控品）上清液5ul,8000rpm离心数秒，放入仪器样品槽。
4.5.3 PCR扩增
将准备好的PCR反应管放置于PCR仪上，编辑样本信息并按下列循环参数进行扩增
反应：37℃-2min；94℃-2min；（94℃-15ses；55℃-45ses）×40 cyclics；
EBV检测荧光素：FAM; 反应体系：50ul； 荧光信号收集：55℃-45ses，末端收
集。
4.5.3 Mx3000P荧光定量PCR仪的设置及结果分析 4.5.3.1 打开计算机电源。
4.5.3.2 将Mx3000P电源开关打开，在大约1分钟的时间内，仪器将会自检并且能听到滤镜
轮转动的声音。打开电脑上的Mx3000P软件，确定软件界面右下面的联机标志呈现绿色
。如果不是绿色而是红色，软件会提示
，这时只需要继续稍等片刻，待仪器自检完成，
会自动连接计算机。
4.5.3.3 在软件的弹出框中选择您要进行的实验类型，通常选择第一
项“Quantitive PCR（Multiple Standards）”进行绝对定量分析。
4.5.3.4 确定卤钨灯已经打开。
灯正在预热；
(绿色)则说明卤钨灯已经打开；
（黄色）则说明卤钨
（红色）则说明卤钨灯没有被打开，这时需要用鼠标点击这个
标志将光源打开。在卤钨灯已经被打开的情况下，软件界面右下方会显示
（绿色）。
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4.5.3.5 最好在仪器与光源预热20分钟后开始实验。 4.5.3.6 在
里，对所选孔进行设定，在Well type中设定Standard
（标准 品）、NTC（阴性对照）、unkown（样品）等，并选择正确的荧光通道（FAM, HEX, ROX，Cy5），参比荧光（Reference dye）选None。对于标准品，在Well type中设定为“Standard”后，再设定其模板浓度。方法为：点击
，10倍的浓度梯度可以直接点击
，在下拉菜单中选择不同的系数关系后，依次点击设定为标准品
的另外几个孔，浓度将实时显示。也可以直接点击标准品的各个孔位， 在
一栏，手工输入浓度。若要对不同的样品进行编号，
则双击所选孔，在name框中输入样品号，点击或者点击版面右上方的
4.5.3.7 点击
就能显示样品编号。
，导入以前使用的96孔板设定。
，进行PCR循环的设定，可以直接点击温度、时间
改
变各项温度、时间、循环数等。在选定大步骤之后添加步骤可选定该大步骤后，点击
，或点击鼠标右键，在弹出的对话框中，选择Add
Segment，则可在该大步骤之后添加一个大步骤；若是在选定大步骤里面的小步骤后边添加一小步骤，选中该小步骤，点击鼠标右键，在弹出的对话框中选择“Add Plateau with Ramp”。
要删除某个大步骤，直接选定大步骤，点击界面右边的“
”，或者点
击鼠标右键选Delete，即可删除该步骤。如果要删除一个大步骤里的小步骤，可先选定此步骤时间和温度中间的横线，将其变红，如图“
，点击界面右边的
，
”，或者点击鼠标右键选Delete，即可删除该步骤。点击
导入以前设定的PCR程序。
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（END）代表在这一步结束时采集荧光信号；（ALL）代表在这一步的全
过程都采集荧光信号，一般用作熔解曲线分析。可直接用鼠标将此图标拖到要采集信号的地方。若要去除
4.5.3.8
，可将其拖出循环设定区域。
。会弹出对话框提示：仪器
结束之后，点击软件界面右上方的
灯源正在预热，需要“马上运行”或者是“灯预热完成后再运行”？通常可直接点击“马上运行”，但最好点击“灯预热完成后再运行”，可以保护灯源。 软件界面右下方会出现运行状态显示框Run Status，点击Start开始实验。在运行过程中可以通过点击Add Cycles来增加扩增的循环数。还可以选择勾选“Turn lamp off at end of run”，在PCR运行结束之后软件将自动关闭卤钨灯。
4.5.3.9 在PCR运行的过程中可以点击4.5.3.10 PCR运行结束后，点击
也可点击击
，观察样品的实时扩增原始结果。
，再点击Results，软件将自动进行结果分析，
手动进行结果分析。可以手动调节阈值线（拖动）进行分析。点
可显示标准曲线，看斜率、截距、线性相关是否在可控范
围内。左下角的可选择相应的荧光观察扩增
曲线。右边的
是扩增曲线，
曲线，
可根据自己的需要选择显示的界面。
Ct值列表，
标准
样本起始浓度，结果excel表格输出，
合并面板，包括设置、程序设定、样本Ct值、扩增曲线四个
面板。
62-EB病毒(EBV)核酸检测规范标准操作技巧规章(荧光PCR法)
