目的：发现pGBKT7-A的相互作用蛋白
方法：以构建到pGBKT7载体上的A基因为诱饵，筛选酵母双杂交禾谷镰刀菌文库，经过对阳性克隆的多重报告基因检测、DNA测序和BLAST比对分析，确定与pGBKT7-A相互作用的蛋白。
材料：
1．诱饵克隆：pGBKT7-A 2．诱饵载体：pGBKT7
3．文库酵母质粒：pGADT7-禾谷镰刀菌cDNA 4．Clontech酵母双杂交系统 5．培养基：
1). 大肠杆菌培养基：
LB：0.5% Yeast extract，1% Polypeptone，1% NaCl。 2). 酵母完全培养基：
YPDA：1% Yeast extract，2% Tryptone，2% Glucose, 0.02% Adenine。 3). 酵母缺陷型筛选培养基：
参照Clontech公司的PT3024-1/Yeast Protocols Handbook。其中各种培养基分别以下列符号表示：
SD-T：-trp；SD-L：-leu；SD-TL：-trp, -leu；SD-TLH：-trp, -leu, -his；SD-TLHA：-trp, -leu,-his, -ade。 4). 其他贮备液：
10×TE：0.1 M Tris-HCl（pH7.5），10 mM EDTA，高压灭菌；
10×LiAc：1 M LiAc (pH7.5)，高压灭菌；
第一部分将诱饵质粒转化受体菌AH109中及其自激活检测 1.1酵母转化
将以下质粒分别转入AH109中：
Reaction
1
pGBKT7-A BD plasmid
类
SD-T
筛库备用&自激活检测
2
pGBKT7
SD-T
照
1.2 酵母转化方法
1. 从YPDA平板挑取AH109单菌落接种于YPDA液体培养基4 ml，30℃，225 rpm，振荡培养18-20 h（过夜），至OD600>1.5。
2. 转接YPDA液体培养基，培养体积为50 ml，使初始OD600=0.2，30℃，225 rpm，振荡培养4-5 h，至OD600=0.6。
3. 离心收菌，室温，4000 rpm，5 min。
4. 用20 ml无菌水重悬菌体，混匀，离心收菌，室温，4000 rpm，5 min，弃上清。 5. 用5 ml 0.1 M LiAc重悬菌体，混匀，离心收菌，室温，4000 rpm，5 min，弃上清。
6. 用500 ul 0.1 M LiAc重悬菌体，混匀，分装至1.5 ml离心管，每个50 ul（每个转化），备用。
阴性对
涂板种
备注
7. 每个1.5 ml离心管中依次加入如下试剂，用枪头吹打混匀，或剧烈振荡1 min左右，至完全混匀。
50%PEG3350
240 ul
1 M LiAc
36 ul
ssDNA mg/ml)
5 ul
(20
质粒DNA
各5 ul
8. 30℃水浴孵育，30 min。 9. 42℃水浴热激，25 min。 10. 30℃水浴复苏，30 min。
11. 离心收菌，室温，4000 rpm，5 min，弃上清。
12. 每个转化用200 ul无菌水悬浮菌体，尽量温和地混匀，涂布相应的缺陷型筛选平板。
13. 30 ℃恒温培养4天。
1.3自激活检测
将pGBKT7- A、pGBKT7转化到AH109，涂到SD/-Trp平板，30℃恒温培养3-4d。随机挑取6个点用pGBKT7的载体引物进行PCR验证，全部为正确克隆，随机取了三个克隆点板至SD/-Trp、SD/-Trp/-His、SD/-Trp/-His/-Ade、SD/-Trp/-His/-Ade+x-α-gal板上，30℃培养3-5d。其中pGBKT7为阴性对照。
图1.自激活检测结果
从图中可得，对照菌株阴性对照pGBKT7能在SD /-Trp平板上生长，在SD/-Trp/-His、SD/-Trp/-His/-Ade、SD/-Trp/-His/-Ade+x-α-gal平板上均不能正常生长。实验组与阴性对照一致。
结论：pGBKT7-A没有自激活现象。
第二部分文库筛选
用含有pGBKT7-A诱饵质粒的AH109酵母菌株作为受体菌制备感受态，将文库质粒pGADT7-禾谷镰刀菌cDNA转入其中，涂SD-TLH筛选平板。
2.1文库DNA转化方法：
1. 从SD-T平板挑取单菌种接于液体SD-T培养基50 ml，30℃，225 rpm，振荡培养24 h。
2. 转接于YPDA液体500 ml，使初始OD600=0.2，30℃，225 rpm，振荡培养4-5 h，至OD600=0.6。
3.离心收菌，室温，4000 rpm，5 min。
4.用30 ml无菌水重悬菌体，混匀，离心收菌，室温，4000 rpm，5 min，弃上清。 5.用20 ml 0.1M LiAc重悬菌体，混匀，离心收菌，室温，4000 rpm，5 min，弃上清。
6.用10 ml 0.1M LiAc重悬菌体，混匀，离心收菌，室温，4000 rpm ，5 min，弃上清。
7.向离心管中依次加入如下试剂，用枪头吹打混匀，或剧烈振荡1 min左右，至完全混匀。
50%PEG3350
1 M LiAc
1.44 ml
ssDNA (10 mg/ml)
文库质粒DNA
9.6 ml 300 ul 25 ug
8. 30℃水浴孵育，30 min。 9. 42℃水浴热激，25 min。 10. 30℃水浴复苏1 h。
11.离心收菌，室温，4000 rpm ，5 min，弃上清，用6ml无菌水重悬菌体，尽量温和地混匀，从中取20 ul培养物稀释后涂SD-TL平板，用于检测文库转化效率。其余涂SD-TLH，共20块。
12. 30 ℃恒温培养3-7天，观察菌落生长。
13. 挑取长出的克隆单菌落，转接到SD-TLH筛选平板中继续培养3-5天。 2.1 筛库结果
在SD-TLH筛选平板中筛选获得阳性酵母克隆。结果如下图所示：
图2. 筛库结果
注：（+）为阳性对照pGADT7-largeT+pGBKT7-p53 （-）为阴性对照pGADT7-largeT+pGBKT7-laminC
筛库结果：筛库的SD-TLH板上菌落生长，所以从平板上挑取了96个克隆进行PCR验证。
第三部分酵母阳性克隆鉴定及测序比对
为了鉴定SD-TLH平板中筛选到的阳性克隆分别是什么基因，需要将这些阳性克隆从酵母细胞中扩增出来进行DNA测序，并与GenBank数据库中的序列进行BLAST比对分析。
注：扩增阳性克隆使用的是南京瑞源生物技术有限公司自主研发的一款快速扩增酵母阳性克隆试剂盒(Yeast Colony Rapid Detection Kit，货号：RY8001)。
测序比对结果
96个阳性酵母克隆，全部PCR扩增，测序成功72个，经过Seqman、BLAST比对，最终获得68个基因序列，比对结果有较多重复的，请自行比对。
第四部分酵母阳性克隆回转验证
将上述划线于SD-TLH 缺陷型平板上长出的阳性克隆转化子分别用无菌水稀释后点至SD-TL、SD-TLH 、SD-TLHA和SD-TLHA+x-α-gal缺陷平板，30℃恒温培养3-4天。
结果如下：
SD-TLSD-TLH SD-TLHA SD-TLHA+x-α-gal
图3.回转验证结果
注：（+）为阳性对照pGADT7-largeT+pGBKT7-p53 （-）为阴性对照pGADT7-largeT+pGBKT7-laminC
回转验证结果表明：
对照菌株阳性对照能在SD-TL、SD-TLH 、SD-TLHA和SD-TLHA+x-α-gal缺陷平板上生长，并能在SD-TLHA+x-α-gal缺陷平板上显色；阴性对照仅在SD-TL平板上能生长，而在其他其他平板都不能生长。
筛选得到的68个酵母阳性克隆，68个阳性克隆能在SD-TL缺陷型平板上正常生长，68个阳性克隆能在SD-TLH 缺陷型平板上生长，36个阳性克隆能在SD-TLHA、SD-TLHA+x-α-gal平板上生长，30个克隆能在SD-TLHA+x-α-gal缺陷平板上显蓝色。
南京瑞源生物技术有限公司坐落于南京市栖霞区生命科技园，专注于基因组高通量研究领域，致力于生物高科技研发，目前产品的技术水平已达到省级实验水平，瑞源生物立足于生命科学，为基础研究领域科学工作者提供生物学技术服务，自2024年创立以来，全体员工致力于利用酵母系统研发新药物靶点，专注于生物学研究，长期与全国各大农林/医药院校在大型科研技术研发上紧密合作。目前已经成熟的产品线如下:酵母文库的构建、酵母双杂交筛选体系酵母单杂交筛选体系、酵母菌落快速鉴定试剂盒、酵母质粒快速抽提试剂盒、蛋白质免疫沉淀检测服务、酵母体系非生物胁迫抗逆性筛选以及 CUT&Tag服务等。
新-酵母双杂交筛选与pGBKT7-A互作的蛋白结题报告
