胎儿游离DNA浓度低导致无创产前检测失败的相关因素研究进展
（cffDNA、NIPT）
随着母血中胎儿游离DNA（cell－free fetal DNA, cffDNA）的发现，无创产前检测（non－invasive prenatal testing, NIPT）技术迅猛发展。大量研究表明，NIPT在胎儿非整倍体检测中具有较高的敏感性和特异性，对21－三体、18－三体和13－三体的检出准确率分别达到99.3％、97.4％和97.4％，总体假阳性率＜1％[1－9]，比唐氏综合征血清学筛查的准确率更高[10]。NIPT主要通过提取母体外周血血浆中的游离DNA片段（包括母体和胎儿的DNA片段），进行基因组测序，并将测序结果进行生物学分析，从而检出胎儿染色体是否存在非整倍性变异。由于其具有无创性，避免了羊膜腔穿刺、绒毛膜活检、脐静脉穿刺等有创性取材方式带来的感染、出血以及流产等风险，所以深受广大孕妇和临床工作者的青睐。新一代的高通量基因测序技术具有快速、自动化、大规模、精确、并行测序等优势，可以精确、快速计算出母体血浆中各种游离DNA的含量，经序列比对计算每条染色体的相对数量，进而发现胎儿21－三体、18－三体、13－三体及少数性染色体异常。
母体外周血中混合了母体和胎儿两者的游离DNA，能否准确检测出胎儿非整倍染色体异常主要取决于cffDNA占母体血中所有游离DNA的比例，即cffDNA浓度。大量研究表明，cffDNA的平均浓度为10％~15％，变化范围可以达到3％~30％，甚至更大[1,11－12]。通常情况下，胎儿
非整倍体的基因筛查要求cffDNA浓度至少达到4％，1％~3％的母体血浆达不到此最低标准[1,12]。如果母血中的cffDNA浓度过低（＜4％），异常的胎儿DNA可能受相对大量的母体正常整倍体DNA影响而无法检测出准确结果，通常建议这部分孕妇重新采血再次检测，如果重采血的cffDNA浓度仍低于4％，则第2次NIPT依然会失败。NIPT失败不仅给孕妇造成困扰，还降低了该技术在临床应用的可行性及优势性。因此，探究影响cffDNA低浓度的因素，分析NIPT失败的原因，针对不同孕妇制定个体化的产前遗传学检测方案，具有重要的临床意义。现就cffDNA低浓度的影响因素进行综述。
一、影响母体外周血中cffDNA浓度的相关因素
目前研究表明，cffDNA浓度受母体和胎儿两方面因素影响，已经证实与孕周呈正相关，与孕妇体重、体重指数（body mass index，BMI）呈负相关，胎儿染色体核型也会影响母血中的cffDNA浓度，孕妇的妊娠期并发症或合并症、年龄、中孕期唐氏综合征血清学筛查的危险系数及胎儿颈项透明层厚度等也是潜在的影响因素[13－28]。
二、cffDNA浓度与孕周的关系
近期研究表明，cffDNA浓度与采血时的孕周有很强的正相关性。随着孕周增加，胎盘体积逐渐增大，凋亡的滋养层细胞增多，因此释放到母血中的DNA片段增加，导致cffDNA浓度升高。国外一项研究纳入了22 384例妊娠10周以上的单胎孕妇进行对照分析，发现cffDNA浓度随孕周增加而升高，但增长速度不一致，从孕10周到孕21周，cffDNA浓度每周升高0.1％，孕21周之后每周升高1％[13]。另一项大样本量（n=140 377）的回顾性队列研究，测定cffDNA浓度，发现孕20周前每周升高0.083％，20周之后每周升高1％，以3.7％的cffDNA浓度为界确定了孕周的临界值为9~10周，这个孕周之前取血，将无法检测出结果[14]。
三、cffDNA浓度与孕妇体重及BMI的关系
研究cffDNA浓度与孕妇体重的关系有助于为肥胖人群选择合适的采血孕周和产前筛查方式，减少无意义的临床行为，避免对孕妇和临床医生造成恐慌与困扰。
2004年，利用特异性Y染色体探针技术测定中孕期母体血浆cffDNA浓度的研究首次发现了孕妇体重与cffDNA浓度之间存在负相关[15]。另一项研究纳入400例孕11~13周的孕妇，孕妇体重范围为60~120 kg，结果显示对应平均cffDNA浓度从12％下降到6％，分析认为cffDNA浓度与孕妇体重的关系主要受母血中总体游离DNA含量的影响，随着孕妇
体重的增长，血容量增加导致血中的总体DNA含量升高，从而稀释了外周血中的cffDNA，使cffDNA浓度降低[16]。后续研究证实了这一观点，该研究分析1 482例孕育整倍体的单胎妊娠孕妇，依据体重、孕周及是否有阴道出血计算出一个预测cffDNA浓度的线性回归方程，即cffDNA拷贝数/ml=6 283×1/体重（kg）+3.6×孕周+12.8×是否阴道出血－16.0[17]。
一项回顾性队列研究将孕妇体重按间隔10 kg分为一组，发现不同体重区间孕妇cffDNA浓度差异有统计学意义（P=0.0003），与体重变化呈负相关，且cffDNA浓度高于4％的比例随体重增长而依次递减，说明体重越大的孕妇发生NIPT失败的概率越高[13]。除此之外，因为母体血容量受体重和身高2方面影响，所以该研究认为用BMI或血容量这种综合的指标替代体重更有意义。因为在肥胖孕妇中，脂肪组织通过脂肪细胞坏死或基底层的血管组织凋亡进行活跃的脂肪重建，脂肪细胞裂解后，游离DNA释放入血，从而导致血中母体来源的DNA含量更高[18]。进而推测，用体脂率代替BMI可能更加准确，因为有些BMI高的孕妇，肌肉含量很高，脂肪含量很低，所以体脂率相对较低，测得的cffDN浓度可能比体脂率高但BMI值低的孕妇更高[16]。但临床上并不常规测定孕妇的体脂率，所以相关研究或应用较难实现。
但也有研究认为，与孕妇BMI相比，孕妇体重与cffDNA浓度的相关性更为显著。该研究将孕妇体重、BMI、血容量、身高按与cffDN浓度的相关性强度进行了排序，由大到小依次为体重、BMI、血容量和身高（Spearman´s ρ=－0.4072、－0.3934、－0.3780和－0.1970），说明与BMI和血容量相比，孕妇体重与cffDNA浓度的关系更接近线性关系[14]。
上述研究表明，孕妇体重或BMI增加会降低cffDNA浓度。因此，为肥胖孕妇确定一个行NIPT检查的合适孕周范围，以降低NIPT失败的发生率具有重要临床意义。一项单中心回顾性队列研究探讨了孕妇BMI与NIPT失败发生率的关系，按世界卫生组织制定的BMI分级将2 385例孕妇按体重逐级分层（偏瘦：BMI≤18.5；正常：BMI 18.5~24.9；超重：BMI 25~29.9；肥胖Ⅰ级：BMI 30~34.9；肥胖Ⅱ级：BMI 35~39.9；肥胖Ⅲ级：BMI≥40），通过分类变量的单因素方差分析发现无论哪个体重级，其NIPT失败的发生率均随孕周的增长而下降。其中BMI＞35（肥胖Ⅱ、Ⅲ级）的孕妇从孕8周到孕16周NIPT失败的发生率有显著下降趋势（下降了4.5％），孕21周后与正常体重孕妇的差异无统计学意义[19]。但NIPT检测孕周越大风险越高，因为可能会延迟胎儿非整倍体的诊断时间。所以对于明显肥胖的孕妇（BMI＞35），适当延迟检测孕周对降低NIPT失败的发生率有一定的可行性。唯一不足的是，该研究没有定量分析cffDNA浓度，NIPT失败也可能是其他因素引起，因此无法显示cffDNA浓度对检测结果的影响[19]。随着NIPT的普及和肥胖孕妇的增加，NIPT
胎儿游离DNA浓度低导致无创产前检测失败的相关因素研究进展(cffDNA、NIPT)
