1.请设计实验，用4种方法证实某种细胞是活的。 【答案】（1）台盼蓝染色。用0.5%浓度的台盼蓝（trypan blue），用PBS配制，室温保存，该染料只对死细胞着色，可测定活细胞数和计算存活百分率。
（2）用碘化丙链（propidium iodide,PI）对细胞进行染色，可以区别坏死及正常细胞。细胞膜是一种选择性的生物膜，一般的生物染料，如PI等不能穿过质膜。当细胞坏死时，质膜不完整，PI就进入细胞内部，它可嵌入到DNA或RNA中，使坏死细胞着色，活细胞不着色。荧光镜下用紫外线激发，高倍镜下观察，没有荧光的则为活细胞。
（3）用相差显微镜观察活细胞，并可在显微镜下连续拍摄记录体外培养细胞的活动，如细胞分裂、细胞迁移运动等过程。
（2）光脱色恢复技术。用荧光素标记膜蛋白，然后用激光照射细胞表面某一区域，使被照射区的荧光猝灭变暗，然后观察膜上荧光的变化，如果一段时间后，猝灭区域的亮度逐级增加，最后恢复到与周围的荧光强度相等.则说明细胞是生活的。
2.为了研究某种特异蛋白在细胞中的定位，可以借助免疫荧光技术或免疫电镜技术。请比较免疫荧光技术和免疫电镜技术各自的优点与不足？并说明免疫电镜技术详细实验步骤（以辣根过氧化物为标记物）。
【答案】①优点与不足：
免疫荧光技术：制样简单快捷，灵敏，有特异性，但分辨率不足。
免疫电镜技术：分辨率高，可同时观察细胞超微结构和蛋白质定位。但制样步骤复杂,抗原易失活。
②免疫电镜技术详细实验步骤：取样→固定→脱水→环氧树脂包埋→超薄切片。
特异蛋白的抗体准备→辣根过氧化物标记抗体→超薄切片在孵育液中孵育（孵育液含DAB,酶标记抗体等）→四氧化锇后固定→电子染色→电镜观察。
3.某研究者发现了一个新的细胞膜蛋白，测序结果表明其为一个多次跨膜蛋白，为了确定跨膜次数及其末端朝向，进行了以下实验：
（1）在细胞内高表达该蛋白，然后通过免疫荧光技术标记该细胞。当用抗N端抗体直接标记活细胞时，质膜上出现荧光；用抗C端抗体标记时却没有。用甲醇固定细胞（此时细胞膜被破坏）后，则质膜上同时出现两种抗体标记的荧光。
（2）将细胞膜分离纯化，再用蛋白酶充分降解膜外部分，然后经SDS-PAGE和银染，发现有10条主带，其中3条在对照细胞（即仅转染了空质粒载体的细胞）的相应样品中也有。
（3）如果先用蛋白酶处理，再分离细胞膜，然后经SDS-PAGE和银染，发现有6条主带，对照样品中有其中的2条。
试根据以上实验结果分析该跨膜蛋白的结构特点。 【答案】（1）说明该膜蛋白肽链N端在胞外、C端在胞内。
（2）说明该膜蛋白可能是7次跨膜，另外3次跨膜结构是质粒载体自身序列表达的。
（3）说明该蛋白肽链在胞内由四部分组成，即3个环状结构域和C端部分，另外的胞内结构区域是质粒载体自身序列表达。
综上所述，该膜蛋白肽链的N端在胞外，C端在胞内；7次跨膜，在胞内和胞外分別有3个环状结构域，其结构模型与7次跨膜的G蛋白偶联受体相似（如下图所示）。
图
4.水是生物体的主要组成成分，虽然能以简单扩散的方式进出细胞，但对于身体的某些器官，水分子必须快速进出细胞。显然，简单扩散不能满足水分子的快速跨膜转运需要。为此，科学家们猜测细胞膜上肯定存有某种与水的跨膜运输息息相关的蛋白质。美国科学家Peter Agre等从血红细胞膜上分离到了第一个水孔蛋白，并通过在非洲爪蟾卵母细胞中表达其基因以及利用脂质体重建实验证实了水孔蛋白对水分子的转运作用。Peter Agre因此获得了2003年诺贝尔化学奖。
(1)请分析在低渗溶液中，表达水孔蛋白的卵母细胞和未表达水孔蛋白的对照组细胞谁更容易吸水膨胀？
(2)为什么非洲爪蟾卵母细胞是一个很好的研究水孔蛋白功能的模型？
(3)相对于非洲爪蟾卵母细胞，将水孔蛋白重建到脂质体膜上，对研究水孔蛋白功能又有什么好处？
(4)水分子既能通过脂双层以简单扩散的方式进出细胞，又能通过水孔蛋白进出细胞。请设计一个实验区分水分子是通过脂双层还是通过水孔蛋白进入细胞？ (5)比水分子小的物质，如，为什么不能通过水孔蛋白？
【答案】(1)表达水孔蛋白的卵母细胞因为允许水分子大量进入细胞而更容易吸水膨胀。
(2)实验结果提示非洲爪蟾卵母细胞质膜上没有水孔蛋白，因此，表达外源水孔蛋白就很容易观察到蛋白的功能。
(3)相对于卵母细胞，脂质体膜上的蛋白成分更清楚，因此，更有利于研究水孔蛋由功能。 (4)可以通过抑制剂，如硝酸银抑制水孔蛋白功能，从而区分水分子是通过脂双层还是通过水孔蛋白进入细胞。
(5)水孔蛋白，如AQP1,只能通过水分子，跟其组成有关，Asn-Pro-Ala的Asn残基所带的正电荷也阻止了质子的通过。
5.请设计一个实验证明线粒体合成ATP的能量来自于内膜两侧的质子浓度差。 【答案】首先制备含有和高浓度的红细胞血影，然后将之放入具有极高浓度的环境中，“细胞”内的向外移动，而向细胞内移动。这两种离子都是沿着各自的浓度梯度向下移动,而不像在生活细胞中那样逆浓度梯度移动。如果在红细胞血影中加入ADP和Pi离子的移动会引起ATP的合成而非ATP的水解。由此可以证明线粒体合成ATP的能量来自于内膜两侧的质子浓度差。
6.某实验室从酵母中克隆了一个基因，并发现它的蛋白质产物与细胞周期的调控有关。为了研究其在人细胞同源蛋白的作用，请设计一套研究方案。
【答案】用RNAi技术。首先根据此基因的序列设计一段双链RNA,它可以和此基因的转录产物mRNA结合从而抑制其翻译成蛋白质产物。因为研究的是人细胞同源蛋白，故二者的编码基因也应存在同源性，故设计RNAi实验是可行的。然后将此dsRNA通过适当的载体导入体外培养的人细胞中,观察细胞的生长与增殖状况，此步可通过流式细胞仪来实现。
7.假设你所在的实验室正在寻找能编码出在细胞周期中起调控作用的蛋白质。由于细胞周期蛋白具有高度的保守性，人类的基因可以在酵母细胞中正确表达出具有功能的蛋白质。现在你手头的材料包括一个人类细胞株、几个酵母细胞株（包括某些能在非允许温度下阻止细胞周期的温敏突变体）、限制性内切酶，同时你也掌握了将外源DNA转入酵母细胞的技术。请设计一个实验来证明并分离一个编码控制细胞周期蛋白的人类基因。
【答案】首先，从人细胞中分离出DNA，用限制性内切酶消化，凝胶电泳分离各个片段。然后将每个片段导入不同的温度敏感型酵母突变体。让这些带有人类基因的酵母突变体在允许温度和禁止温度下生长，能够在禁止温度下生长的酵母细胞被人DNA“挽救”了，该DNA中必然含有编码细胞周期蛋白的基因，补偿了酵母自身突变的蛋白。再从这些被“挽救”了的突变细胞中分离出人DNA——此DNA带有编码细胞周期调控蛋白的关键基因。 8.如果在鸡胚胎组织细胞的培养实验中需要完成下列操作，回【答案】 （1）如何分散组织细胞，怎样测定分离细胞的密度及其存活率。 （2）如需制备原代细胞的染色体标本，列出关键实验操作。
2021年北京大学925中国地理考研精品资料之翟中和《细胞生物学》考研核心题库之实验题
