悬浮细胞传代及细胞计数
一、 细胞传代
实验目的：掌握悬浮细胞传代技术。进一步掌握细胞培育的操作技术。 实验原理：
培育细胞生长一按时刻后，需分离再培育，不然细胞因生存空间不够，细胞密度过大，致营养不足而引发细胞衰老、停止生长乃至死亡。为了维持细胞的存活和生长，必需进行再培育，即将原培育瓶内细胞分离、稀释、接种到新培育瓶内继续扩大培育。
实验用品： （一）仪器
净化工作台、离心机、恒温水浴箱、冰箱（4℃、-20℃、-70℃）、倒置相差显微镜、培育箱；
（二）玻璃器皿
吸管（弯头、直头）、培育瓶、废液缸、 （三）塑料器皿
吸头、枪头、胶塞、移液管、15ml离心管、离心管架
（四）其他物品
微量加样枪、计数板、记号笔、移液枪 （五）试剂
1640培育液、PBS
操作步骤： 1. 预备：
打开培育液，PBS；
掏出离心管，拧开管盖，管盖倒放。从吸管筒中依次掏出吸管，装上吸头，插入离心管备用。
2. 从培育箱内掏出细胞，放在显微镜下观察其生长状态、密度。 3. 第一观察培育板孔中培育液量。用吸管别离吸出两个孔中的细胞连同培育液，转入离心管中。再另取一只吸管吸取PBS，放入培育板孔中，轻轻吹打孔壁，吸出转入离心管。
4. 离心，设置离心机1000转/分，4-5分钟。
5. 掏出离心管，轻轻吸出上清，倒入废液缸。吸取培育液约7ML放入离心管，轻轻吹打细胞，使之均匀悬浮。
6. 吸取1ML细胞悬液1ML转入EP管中，备计数用。 7. 其余的细胞别离放入六个孔中，每孔约1ML。 8. 吸取培育液加入板孔中至1/3孔容量。
9. 镜下观察细胞是不是散布均匀，放入培育箱培育。
二、细胞计数及生长曲线测定
培育细胞生长进程：暗藏期→指数增生期→停滞期 暗藏期(latent phase)
细胞接种后,先通过一个在培育液中呈悬浮状态的悬浮期.现在,细胞质回缩, 胞体呈圆球形.然后细胞贴附于载体表面,称贴壁,悬浮期结束. 细胞贴壁速度与细胞种类, 培育基成份,载体的理化性质等紧密相关。一般情形下，原代培育细胞贴壁速度慢,可达10-24 小时或更多, 而传代细胞系贴壁速度快, 通常10-30 分钟即
可贴壁。细胞贴壁后还需通过一个暗藏阶段，才进入生长和增殖期.原代培育细胞暗藏期长，约24-96 小时或更长, 持续细胞系和肿瘤细胞暗藏期短，仅需6-24 小时。
(2) 指数增生期(logarithmic growth phase)
这是细胞增殖最旺盛的阶段，割裂相细胞增多。指数增生期细胞割裂相数量可作为判定细胞生长是不是旺盛的一个重要标志。通常以细胞割裂相指数（Mitotic index, MI）表示，即细胞群中每1000 个细胞中的割裂相数。一般细胞的割裂指数介于%%，原代细胞割裂指数较低，而持续细胞和肿瘤细胞割裂相指数可高达3％－5％。指数增生期的细胞活力最好时期，是进行各类实验最佳时期，也是冻存细胞的最好机会。在接种细胞数量适宜情形下，指数增生期持续3－5 天后，随着细胞数量不断增多、生长空间减少，最后细胞彼此接触汇合成片。正常细胞彼此接触后能抑制细胞运动，这种现象称接触抑制现象(contact inhibition)。而恶性肿瘤细胞无接触抑制现象，能继续移动和增殖，致使细胞向三维空间扩展，使细胞发生堆积（piled up）。细胞接触汇合成片后，虽然发生接触抑制，但只要营养充分，细胞仍能进行增殖割裂，因此细胞数仍然在增多。可是，当细胞密度进一步增大，培育液中营养成份减少，代谢产物增多时，细胞因营养枯竭和代谢产物的影响，致使细胞割裂停止，这种现象称密度抑制现象（Density Inhibition）。
（3）停滞期(Stagnate phase)
细胞数量达到饱和密度后，如不及时进行传代，细胞就会停止增殖，进入停止期。现在细胞数持平，故也称平台期（Plateau phase）。停滞期细胞虽不增殖，但仍有代谢活动。如不进行分离传代，细胞会因培育液中营养耗尽、代谢产物积
悬浮细胞培育技术讲义
