嗜热四膜虫三种含有锌指结构域蛋白的功能研究
【摘要】：嗜热四膜虫是一种单细胞真核模式生物,细胞中含有一个大核和一个小核。大核负责基因的转录,小核负责遗传物质的传递。在营养生长期,细胞通过无性生殖方式获得后代。在饥饿期,不同交配型的细胞配对,进行有性生殖。在有性生殖过程中,小核进行两次减数分裂和一次有丝分裂,形成配子核,配子核交换后融合形成合子核,合子核通过两次连续有丝分裂,形成四个新的细胞核,其中两个发育为新的大核,另两个发育为新的小核,随后亲本大核降解。在新的大核形成过程中,大核基因组DNA发生了基因组规模上的程序化重排。尽管RNAi相关的分子机制参与了嗜热四膜虫基因组重排的过程,然而确切的分子调控网络目前并不完全清楚。含有锌指结构域的蛋白在基因转录、mRNA运输、细胞骨架组成、细胞粘附、蛋白折叠和核染色质重塑等细胞发育过程发挥着重要的作用。四膜虫大核基因组中含有多种编码锌指结构域的基因,本研究通过对四膜虫全基因转录组Microarry表达图谱和基因Network分析,鉴定了三种在四膜虫有性生殖时期特异性表达的含有锌指结构域的编码基因,ZFR1,ZFR2和ZFR3。对这三种基因在嗜热四膜虫有性生殖过程中的表达、定位和对细胞核发育的影响进行了研究,获得的主要结果如下：
1.ZFR1、ZFR2和ZFR3的生物信息学分析ZFR1基因(TTHERM_01285910)全长1538bp,开放读框预测编码448aa。N端含有一个非典型的40aa的B-Box锌指结构域,C端含有一段疏水区。ZFR2基因(TTHERM_00637350)全长1433bp,开放读框预测编码426aa。含有一个C3HC4型RINGfinger锌指结构域。ZFR3基因(TTHERM一00531890)全长2846bp,开放读框预测编码928aa,含有一个C3H2C3型RINGfinger锌指结构域。Genenetwork分析表明ZFR1、ZFR2和ZFR3为共表达基因,ZFR1与ZFR2、ZFR3的功能相关系数值分别为7.88和7.08。2.Zfrlp特异定位在四膜虫conjugationjunction结构上,对有性生殖发育完成是必需的实时荧光定量PCR分析表明ZFR1基因在生长、饥饿期都无表达,在有性生殖时期特异表达且在2h表达水平最高。免疫荧光定位结果表明,Zfrlp特异定位在四膜虫conjugationjunction结构上。Zfrlp的锌指结构域或C端疏水区被截断后,截断蛋白滞留在高尔基体。表明这两个结构域对该蛋白靶向运输起关键作用。为了分析Zfrlp在细胞中的功能,构建了ZFR1体细胞敲除的细胞株。突变体细胞株有性生殖前期稳定性降低,而过表
达Zfrlp提高了配对细胞的稳定性。ZFR1体细胞敲除的突变体细胞株在配子交换与融合时期发育终止。结果表明Zfrlp蛋白对维持配对细胞的稳定性和有性生殖发育完成是必需的。3.Zfr2p调控新大核发育过程中IES删除实时荧光定量PCR分析表明ZFR2基因在生长、饥饿期均无表达,在有性生殖时期特异表达且在2h表达水平最高。免疫荧光定位结果表明Zfr2p定位在四膜虫有性生殖时期的亲代大核、新生成的大核和凋亡的大核上。同时,Zfr2p也定位于conjugationjunction结构。为了分析Zfr2p在细胞中的功能,构建了ZFR2的体细胞敲除细胞株。在有性生殖过程中,ZFR2基因敲除突变体细胞株发育到配子核交换时期,大约65%的配对细胞异常分开,部分细胞继续发育到两个大核和两个小核时期。当用野生型细胞或过表达细胞和突变体细胞配对,同样只有少量配对细胞能完成发育。对突变体细胞发育后代进行基因组序列重排分析发现,小核特异的IES序列中的M、R和部分Cal元件无法被删除,染色体不能断裂,甲基化H3K27定位表明新大核无法形成DNA删除异染色质结构,最终导致发育中的新大核DNA降解,细胞死亡。结果表明Zfr2p对新大核发育过程中IES删除和染色体断裂以及后代大核中DNA删除异染色质结构形成和DNA复制是必需的。4.Zfr3p调控有性生殖的正常进行实时荧光定量PCR分析表明ZFR3基因在生长、饥饿期都无表达,在有性生殖过程中2h和6h表达显著上调。免疫荧光定位表明Zfr3p定位在有性生殖发育时期的小核和即将凋亡的亲本大核上。为了分析Zfr3p在细胞中的功能,构建了ZFR3的体细胞敲除细胞株△ZFR3-S1和△ZFR3-S2。在有性生殖过程中,ZFR3基因完全敲除的突变体细胞株在发育到配子交换时期,发育异常终止。表明Zfr3p对四膜虫有性生殖发育是必需的。Zfr3p在凋亡的亲本大核上的定位显示,该蛋白有可能参与了亲本大核的泛素化降解途径。5.ZFR1,ZFR2和ZFR3存在相互的调节ZFR1,ZFR2和ZFR3具有相似的表达图谱,并且对四膜虫有性生殖的正常发育是必需的。实时荧光定量PCR分析表明ZFR1基因的敲除引起ZFR2和ZFR3表达量的显著下调。ZFR3基因的敲除也会引起ZFR1和ZFR2表达量的下调,但ZFR2基因的敲除却对ZFR1和ZFR3的表达不产生影响,表明ZFR2在共表达基因的下游。本研究首次对嗜热四膜虫大核基因组中三种编码含有锌指结构域蛋白的ZFR1,ZFR2和ZFR3的表达、细胞定位和功能进行了系统分析。ZFRl,ZFR2和ZFR3具有相似的表达图谱,但表达的蛋白具有不同的定位模式。基因
敲除突变体的表型分析发现,每一种基因敲除突变体细胞的发育异常终止于配子核交换的时期,暗示它们参与了相同的信号通路。ZFR1和ZFR3基因敲除影响了ZFR2的表达,Zfr2p不仅影响了配子核交换时期的细胞发育,而且对新大核发育过程中IES删除和染色体断裂以及后代大核中DNA删除异染色质结构形成和DNA复制是必需的。【关键词】：嗜热四膜虫锌指蛋白细胞定位基因敲除有性生殖【学位授予单位】：山西大学【学位级别】：博士【学位授予年份】：2013【分类号】：Q51【目录】：中文摘要10-13ABSTRACT13-17第一章文献综述17-291.1四膜虫概述17-251.1.1四膜虫的形态17-181.1.2四膜虫的进化地位18-191.1.3四膜虫核的二态性191.1.4四膜虫的生殖19-241.1.5嗜热四膜虫的培养与应用24-251.2锌指蛋白概述25-271.2.1锌指结构域的分类25-261.2.2锌指蛋白的功能26-271.3嗜热四膜虫锌指结构域蛋白及本课题研究意义27-281.4实验设计28-29第二章嗜热四膜虫中ZFR1基因的功能分析29-672.1材料29-332.1.1菌株与质粒292.1.2试剂与工具酶29-302.1.3主要试剂30-312.1.4主要实验仪器31-322.1.5PCR扩增引物32-332.2方法33-442.2.1嗜热四膜虫细胞的培养、饥饿和配对33-342.2.2嗜热四膜虫基因组的提取342.2.3ZFR1基因的克隆34-352.2.4ZFR1基因的生物信息学分析35-362.2.5ZFR1基因的表达谱分析362.2.6ZFR1基因大核敲除载体的构建36-372.2.7构建体DNA片段浓缩372.2.8嗜热四膜虫的转化37-382.2.9突变细胞株的筛选38-392.2.10ZFR1突变株的qRT-PCR鉴定392.2.11ZFR1基因敲除的突变体细胞株△ZFR1-B和△ZFR1-C的发育392.2.12ZFR1敲除突变株后代存活分析392.2.13HA-ZFR1的构建39-402.2.14HA-ZFR1构建体的转化和重组突变细胞株筛选鉴定402.2.15HA-ZFR1的蛋白免疫印迹40-412.2.16免疫荧光定位41-422.2.17HA-ZFR1过表达构建体(MTT1-HA-ZFR1)的构建422.2.18HA-ZFR1过表达构建体的转化和突变细胞株的筛选鉴定42-432.2.19Conjugationjunction稳定性实验432.2.20截断型ZFR1的构建432.2.21蛋白转运抑制剂(BrefeldinA)处理HA-ZFR1突变细胞43-442.2.22紫杉醇和秋水仙碱处理HA-ZFR1突变细胞442.3结果44-622.3.1ZFR1基因分析44-482.3.2ZFR1对四膜虫营养生殖的功能不是必需的48-492.3.3ZFR1影响嗜热四膜虫有性生殖进程49-532.3.4ZFR1在嗜热四膜虫中的定位53-562.3.5过表达的ZFR1在细胞中的定位56-582.3.6过表达细胞株在有性
嗜热四膜虫三种含有锌指结构域蛋白的功能研究
