凝胶定量软件Quantity One使用简介
1 内容简介
凝胶电泳是每个做分子生物学的同学天天都要打交道的基本技术。电泳之后的信息处理与电泳本身同样重要。目前有大量软件可以用于分析电泳结果,比较有名的比如BandScan、BandLeader、Sigma Gel等等。今天要向大家介绍的是来自Bio-Rad的1D凝胶定量软件Quantity One(Bio-Rad还有一个做2D凝胶分析的软件PDQuest)。这个软件的最新版本可以在Bio-Rad的主页免费下载。
2 Quantity One的定量方法
Quantity One的分析功能顾名思义主要用来进行凝胶或者培养皿的荧光定量分析。它的分析功能或者说分析方式主要有4种:泳道/条带轨迹定量法;等高线直接定量法;菌落计数;分子量测定
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这三种方法中使用最为方便也是最为广泛的应该是等高线定量法(Volumn Contour)。它通过半自动描绘电泳条带的等高线边缘来得到等高线区域内部面积,再将该面积乘以区域内平均光密度值得到条带内部总的信号量。当然这种分析方法的弊病显而易见:无法同等得排除不同泳道的背景亮度;等高线的绘制处于“半自动”状态,即需要人为判断作为等高线标准的电泳条带的边缘;最致命的是在几个电泳条带距离十分接近的时候几乎无法绘制单一条带的轮廓(常出现连续的几个条带等高线相连而无法分离出单独条带的轮廓)。
三种方法中个人感觉最为科学和严谨的应该是泳道/条带轨迹定量法(Trace Tracking)。这种方法使用起来步骤较为繁琐,必须通过泳道识别---电泳条带识别两个连续的步骤才能进行定量。然而这种方式的最大优点在于它可以完全抛弃人为
主观因素进行全自动定量。他的定量方式为:首先根据不同电泳条带的光密度值绘制光密度曲线,然后计算光密度曲线下面积作为电泳条带的定量根据。大家可能会问他能不能排除泳道背景?答案是肯定的,它能够最大程度的排除不同泳道之间的背景差异,让各个泳道上的不同电泳条带在一条几乎相同的起跑线上进行对比。这个背景排除功能是等高线法无法做到的(等高线法也有基本的背景排除办法,但是和泳道/条带轨迹定量法的背景排除不是一个等级的。等高线法只能排除同一泳道上的背景,而不能均等的排除不同泳道的背景)。另外泳道/条带轨迹定量法还可以结合Gauss Model Bands对紧密相连的电泳条带进行分析,而这种条带也是等高线法无法分析的。我们此次重点学习这个方法。
第三个分析功能是菌落计数(Colony Counting)。这个功能其实很实用,可以分析蓝白筛选的结果。但是很奇怪我的电脑居然无法运行这个功能,因此无法向大家介绍了。
另外Quantity One还可以通过回归曲线测定
3 Quantity One的基本常用菜单操作
下面让我们了解一下Quantity One常用的基本菜单操作。
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打开文件:由于Quantity One是Bio-Rad的硬件配套软件,因此Quantity One 可以自动输入来自Bio-Rad公司的凝胶分析仪的数据。具体支持哪些硬件大家可以在“Edit-Preference-Imagers”里面设置。如果您的实验室没有采用
Bio-Rad的硬件设施也没关系。您只要将电泳图片用ACDSee等程序转换为TIF 图片格式就可以被Quantity One识别了。注意Quantity One只支持8位和16位灰度的TIF文件。
PHP代码:
Quantity One似乎有一个小bug,就是在按“Open”之后并没有立刻弹出资源管理器让你选择目标文件的位置。其实你只要将鼠标在屏幕右下方点击一下,资源管理器就会乖乖弹出来了.
PHP代码:
Quantity One只能分析白色背景+黑色条带的电泳图。而我们正常情况下得到的一般都是黑色背景+白色条带的电泳图。我们可以在“Image-Invert data中将图片色彩进行反转,然后便可以用Quantity One进行分析了.
文字注释:Quantity One提供基本的文字注释功能。您可以在您的电泳图片上记录您的分析结果比如电泳条带的分子量、光密度值、物质的量等等。这个功能可以通过“Edit-Text Overlay Tools”来实现。在弹出的浮动工具栏中选择“ABC”或者“”就可以进行文字输入和画标记线的操作。
光密度工具:在“View-Plot Density”的下级菜单中大家会见到几个和电泳条带光密度值相关的显示选项。大家可以分别选择不同的选项感受一下它们之间的差别。选择方法是点击相应的下级菜单比如“Plot Cross Section”,然后将变成带一个蓝色感叹号的鼠标移到您想知道光密度的位置,点击一下就会显示该处的光密度相关信息。在下面这幅图片中我们可以看见两条黄线交叉处的电泳条带的相关信息。上方的一串曲线是不同泳道之间在同一水平线上的光密度比值曲线;左边是黄线交叉处所在泳道的几个电泳条带的光密度分布情况。
3D Viewer:在“View-3D Viewer”菜单中大家会看到一个有趣的功能叫做3D Viewer。这个玩意按照Bio-Rad的说法可以辅助辨别几条紧密相连在一起的电泳条带的分布情况。大家只要选择了这个命令后鼠标就会一个“+”型,然后将+型移动到您感兴趣的位置,拖动鼠标画出一个正方形区域,然后用鼠标双击,
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