多糖类衍生物在以高效液相色谱法为基础的手性分离中的应用
摘要
手性药物的两个对映异构体在药理作用和生理活性方面的显著差异，对其进行手性拆分有重大的意义，使得手性拆分成为分离及分析领域中的研究热点。以手性固定相(Chiral stationary phase, CSP)为基质的高效液相色谱法(High performance liquid chromatography, HPLC) 因其分离效能高、选择性高、灵敏度高和分析速度快等优点，已成为不对称合成反应监测、光学纯度分析和手性化合物拆分等方面的最重要的方法。以多糖类衍生物为原料制成的手性固定相被认为具有优良分离性能。
1.1引言
法国化学家巴斯德（Pasteur）说：“生命向我们显示的乃是宇宙不对称的功能。宇宙是不对称的，生命受不对称作用支配。” 含有不对称因素的化合物分子在空间排列上互为镜像关系，但又不能完全重叠，就像人的左手和右手一样，我们称之为“手性化合物”。构成手性关系的两个分子称为一对对应体[1]。一对对映体之间除旋光性不同之外，在非手性环境下其物理性质和化学性质基本相同。
手性是存在于自然界的普遍现象，大至星系旋臂、行星自转、大气气旋，小到矿物晶体、有机分子，从无生命的物体，到生命现象，无处不充斥着手性的倩影。生命活动也都是在手性环境中进行的[2]，生物体内的蛋白质、糖和核酸等都是由单一手性的氨基酸和糖单元组成的。在机体代谢过程中所涉及的酶及细胞表面受体等物质一般也都是手性的。因此对于许多手性药物而言，其对映体之间的生理活性往往存在显著的差异，其中一种对映体具有理想的药效，而另一种对映体可能表现出不同的药理作用，甚至毒副作用[3]。例如，S-构型的丙氧芬具有镇咳作用，而R-构型的丙氧芬可用作止疼药；只有S-构型的氧氟沙星具有抗菌作用；奎宁为抗疟疾药，而奎尼丁具有较大的心脏副作用和降血压作用[4]。
然而，在1980年以前，由于缺乏能够对对映体进行分析和分离的有效的方法，制备单一异构体的手性药物相当困难，许多手性药物都是以外消旋体的形式给药[5]，由此 对手性药物的拆分和药理研究已成为制药行业的迫切需求。为此，美国、日本和欧洲等地的药品管理部门相继出台了相关法规，对手性药物的开发和使用进行规范。要求新的
手性药物在上市前必须说明其中各对映体的药理、毒性和临床效果[6]，对于两种对映体的药理作用差异较大的，必须以单一对映体的形式上市，并鼓励把已在销售的外消旋体药物拆分为单一手性的药物。近年来，手性药物的巨大市场也成为世界各国制药公司追求利润的新目标，1990年手性药物的市场销售额只有180亿美元，1997年达到了879亿美元，到2005年已达到1720亿美元，并且市场份额还在以每年8%的速度递增。由此可见，制备单一对映体的化合物不仅对生命科学和药物化学具有十分重要的意义，并且还会带来巨大的经济效益[7]。
1.2手性分离方法
自从Pasteur于1848年报道了首例对外消旋酒石酸进行手性拆分以来，关于手性拆分的研究已逐步成为学术界关注的热点。目前获得单一对映体的手性化合物主要有手性源合成法、不对称合成法和外消旋体拆分法三种。手性源合成法是以天然存在的单一对映体的手性化合物为原料，合成其他手性化合物的单一对映体，这种方法操作简单且产物纯度高，因此最为常用。但是由于天然存在的手性化合物种类有限，使得其应用范围非常受限。不对称合成法是在酶或者催化剂的作用下合成过量的单一对映体手性化合物的方法，这种方法在近30年来发展迅速，有些反应已经实现产业化，但是要做到高旋光收率的反应（ee值大于90%）仍然有许多困难。外消旋体拆分法是在手性助剂的作用下将外消旋体化合物拆分为两个单一对映体的方法。外消旋体拆分的方法包括化学拆分法、生物拆分法和色谱拆分法。化学拆分法是将一对对映体与纯手性物质形成非对映异构体，利用其性质的差异进行拆分，再将衍生物还原，该方法操作周期长，且通常只适用于酸碱类物质。生物拆分法是利用酶或者微生物对某一对映体的专一识别能力，消耗掉其中一种单一对应体而得到另一种对映体的方法 ，但也正因为生物识别的专一性使得该方法的适用性非常受限。而色谱拆分法就可以满足不同条件下对映体分离和分析的要求，不仅能够进行简便快捷的定性定量分析，还能进行制备级的分离和微量测定。因此，与其他拆分方法相比，色谱拆分法体现出许多明显的优越性，已成为手性拆分最常用最有效的方法。
色谱法主要包括：高效液相色谱法（HPLC）、气相色谱法（GC）、薄层色谱法（TLC）、毛细管电泳法（CE）和超临界流体色谱法（SFC）[8]。在这些色谱法中，高效液相色谱法因其柱容量高、操作简便、分析速度快、检测灵敏度高，并且不会对溶质造成破坏等
优点，已被广泛应用于医药、化学、环保及食品工业等领域[9]。
1.3高效液相色谱法
液相色谱最初是由俄国植物学家Tswett于1906年发明的，在随后的50多年内，经Martin和James等人的发展，相继出现了分配色谱、气相色谱和薄层色谱等一系列色谱方法。在20世纪60年代末，随着机械、光学、电子等技术的进步以及高压泵和化学键合型固定相在液相色谱中的应用，高效液相色谱应运而生，并且因其分离效率高、效果好、精密度高及应用范围广等优势而得到快速发展。目前， HPLC已成为对映体检测和拆分的最主要的方法，超过70%的手性化合物的e.e.值检测和对映体拆分都是通过HPLC法完成的[10]。
高效液相色谱法从拆分原理上可分为手性衍生化法、手性流动相法和手性固定相法三种。手性衍生化法又称为间接法，即将待分离物与衍生化试剂反应形成以对非对映体，然后在非手性条件下实现分离。手性衍生化法对衍生化试剂纯度要求高，且需要对样品进行预处理，容易造成衍生化试剂的消旋化，应用非常受限。手性流动相法是将手性添加剂加入到流动相中，与待分离物形成一对非对映体络合物，在普通色谱柱上进行分离
[11]
。该方法所依据的原理与手性衍生化法基本相同，无需对样品进行预处理，但添加剂
的选择非常严格，可拆分的化合物有限。手性固定相法则是通过固定相表面的手性选择体与样品之间形成暂时的非对映体络合物，利用这种非对映体络合物之间的稳定性或者能量差异而实现分离[12]。手性固定相法样品制备方便，分析速度快，定量分析可靠性高，能广泛适用于各类化合物，因此在近年来得到了快速发展。但是目前仍然没有一种广谱的手性固定相，所以需要根据样品的结构来选择合适的手性柱。
1.4手性固定相
手性固定相（chiral stationary phase，CSP）一般由载体和附着在其表面的手性选择体组成。按照手性选择体的结构不同可将手性固定相分为以下几类：刷型手性固定相、冠醚类手性固定相、环糊精类手性固定相、大环抗生素类手性固定相、蛋白质类手性固定相和多糖衍生物手性固定相[13]。其中，多糖衍生物，尤其是纤维素和直链淀粉衍生物手性固定相因其卓越的分离性能而倍受关注[14]。
1.5多糖衍生物手性固定相
多糖化合物是自然界含量丰富的具有光学活性的天然聚合物，多糖化合物本身因具有高度有序的螺旋结构，早在20世纪中叶，纸色谱中就发现了这类分子具有手性识别能力[15]，但是天然多糖因其本身手性分离能力较弱，不适合作为CSP使用。直到1973年，Hesse和Hagel[16]首次将微晶形态纤维素乙酰化反应得到了微晶纤维素三乙酯（MCTA），并成功拆分了特罗格尔碱（Troger' s base），此后，各种多糖衍生物才被用作手性固定相，并分离了大量的手性化合物。在这些天然多糖衍生物中，应用最多且手性识别能力被公认为最好的是纤维素和直链淀粉衍生物[17]。 图1-1纤维素和直链淀粉的三苯基氨基甲酸酯衍生物的结构[18]
1984年，Okamoto等[19]将MCTA涂覆在硅胶表面，制备成的手性固定相比前者具有更高的手性识别能力。从20世纪80年代开始，多糖衍生物手性固定相得到了空前的发展。该课题组还将纤维素（直链淀粉）与苯基异氰酸酯反应得到纤维素（直链淀粉）三苯基氨基甲酸酯衍生物，Okamoto等合成了一系列此类多糖衍生物（图1-1），并将这些多糖衍生物涂敷到硅胶上后，得到了当前应用最为广泛的一类多糖类CSP，并系统地研究了其手性识别机理[20]。总体上，当修饰剂苯环上的间位或对位上含有吸电子基团或供电子基团时，以相应衍生物所制备的CSP具有较好的手性识别能力。其中以纤维素-三（3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯）（Cellulose Tris(3,5-dimethylphenylcarbamate), CDMPC）和直链淀粉-三（3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯）(Amylose Tris(3,5-dimethylphenylcarbamate，ADMPC)所制备的手性固定相的分离性能最为突出，其相应的固定相均被商品化[21]。
其它类型的多糖，如甲壳素（Chitin）、壳聚糖（Chitosan）、葡聚糖（Dextran）、木聚糖（Xylan）、半乳糖胺（Galactosamine）和菊粉（Inulin）等[22]也可以被3,5-二甲基苯基异氰酸酯或3,5-二氯苯基异氰酸酯修饰来制备CSP。甲壳素、壳聚糖和木聚糖的3,5-
二甲基苯基氨基甲酸酯以及甲壳素和半乳糖胺的3,5-二氯苯基氨基甲酸酯都表现出较好的手性识别能力。
制备多糖类衍生物CSP最经典的方法是把多糖衍生物涂敷于硅胶表面制备成涂敷型的CSP。该方法是由Okamoto等在1984年[22]逐渐发展起来的，该方法使固定相的机械稳定性和柱效得到了显著地提高，促进了多糖衍生物手性固定相的发展。2004年，Dicke[23]首先报道了对直链淀粉2-位羟基进行选择性酯化的方法。在此基础上，Okamoto等[24]利用这种方法合成了多种2，3，6位羟基分别为不同取代基修饰的淀粉衍生物。2012年，Tang等[25]使用4种取代位置不同的氯甲基苯基异氰酸酯对纤维素2，3，6位上的羟基进行选择性修饰，其中纤维素2,3-二（3-氯-4-甲基苯基氨基甲酸酯）-6-（3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯）和纤维素2,3-二（3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯）-6-（3-氯-4-甲基苯基氨基甲酸酯）具有较好的手性识别能力。
但是，在实际应用中，使用四氢呋喃（THF）、氯仿、乙酸乙酯、丙酮等有机溶剂作为流动相时，会使多糖衍生物发生溶解或溶胀[26]，缩短了手性柱的使用寿命，最终失去手性分离能力。如纤维素-三（3,5-二氯苯基氨基甲酸酯），甚至在典型的正相流动相中都会溶胀，这些缺点使涂敷型CSP的使用范围受到限制。为了解决上述问题，Okamoto等研究出了新的制备CSP的方法，即采用化学键结合的方法制备键合型多糖手性固定相
[27]
。目前，用于制备键合型手性固定相的化学反应主要有三种：即自由基共聚反应、双
官能团偶联反应、分子内交联聚合[28]。由Okamoto等[29]人发明的分子内交联聚合法制备的键合型CSP较前二者在保证交联效率和保留了衍生物规整结构方面更有优势。在进行键合反应时，需引入与载体成键的基团，这对手性分子结构的规整性有一定程度的影响，导致手性识别能力降低，在手性分离方面，键合型CSP无法与涂敷型CSP相媲美。而且其制备过程也较为复杂，交联剂的用量至关重要，很难准确掌握，固定相的制备过程不易重复。虽然键合型CSP比相应的涂覆型CSP的手性识别能力略有降低，但是极大地拓展了多糖类CSP的流动相的应用范围，弥补了手性识别能力相对较低的缺陷，己受到愈来愈多的关注。
1.6手性色谱拆分机理
在对手性色谱拆分机理的研究过程中，提出过多种手性识别模型，但这些模型大多都是以Dalgliesh在1952年提出的“三点相互作用”理论为基础建立的[30]。根据这一理论，在一对对映体和手性选择体之间，至少要有三种分子间相互作用力同时存在，并且其中
环境分析化学作业
