生物选修三·现代生物科技专题
【专题一·基因工程（DNA重组技术）】
（一）基因工程的基本工具 ．．．．．．．．．．．．
1.“分子手术刀”——限制性核酸内切酶（限制酶）
（2）功能：识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开，因此具有专一性。
（3）结果：经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式：黏性末端和平末端。 2.“分子缝合针”——DNA连接酶
(1)两种DNA连接酶（E·coliDNA连接酶和T4-DNA连接酶）的比较： ①相同点：都缝合磷酸二酯键。
②区别：E·coliDNA连接酶源于T4噬菌体，只能将双链DNA片段互补的黏性末端之间的磷酸二酯键连接起来；而T4DNA连接酶能缝合两种末端，但连接平末端的之间的效率较低。
(2)与DNA聚合酶作用的异同:聚合酶只能将单个核苷酸加到已有的核苷酸片段的末端，形成磷酸二酯键。DNA连接酶是连接两个DNA片段的末端，形成磷酸二酯键。 3.“分子运输车”——载体
（1）载体具备的条件：①能在受体细胞中复制并稳定保存。②具有一至多个限制酶切点，供外源DNA片段插入。③具有标记基因，供重组DNA的鉴定和选择。
（2）最常用的载体是：质粒 裸露 结构简单 独立于细菌染色体之外 具有自我复制能力 双链环状DNA分子。
（3）其它载体： 噬菌体的衍生物、动植物病毒 (二)基因工程的基本操作程序 ．．．．．．．．．．．．．．第一步：目的基因（编码蛋白质的结构基因）的获取
1、原核基因采取直接分离获得，真核基因是人工合成。人工合成目的基因的常用方法有反转录法_和化学合成法_。
3.PCR技术扩增目的基因 （1）原理：DNA双链复制
（2）过程：第一步：加热至90～95℃DNA解链；第二步：冷却到55～60℃，引物结合到互补DNA链；第三步：加热至70～75℃，热稳定DNA聚合酶从引物起始互补链的合成。 第二步：基因表达载体的构建
1.目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传至下一代，使目的基因能够表达和发挥作用。 2.组成：目的基因＋启动子＋终止子＋标记基因
（1）启动子：有特殊结构的DNA片段 位于基因的首端 是RNA聚合酶识别和结合的部位 能驱动基因转录出mRNA
（2）终止子：也是一段有特殊结构的DNA片段 ，位于基因的尾端。 （3）标记基因的作用：是为了鉴定受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来。常用的标记基因是抗生素基因。 第三步：将目的基因导入受体细胞_ 一、常用的转化方法：
①将目的基因导入植物细胞：·农杆菌转化法（双子叶植物和裸子植物 幼苗时期） ·基因枪法（单子叶植物） ·花粉管通道法（受粉后 花粉管道未愈合前 剪去柱头 滴加DNA 转基因抗虫棉） ②将目的基因导入动物细胞：显微注射技术（受体细胞多是受精卵 “超级小鼠”） ③将目的基因导入微生物细胞：（作为受体细胞的原因是 繁殖快 多为单细胞 遗传物质相对较少 ，最常用的原核细胞是 大肠杆菌 转化方法：先用Ca处理细胞 使其成为感受态细胞 再将重组表达载体DNA分子溶于缓冲液中与感受态细胞混合 在一定的温度下促进感受态细胞吸收DNA分子
第四步：筛选含有基因表达载体受体细胞（依据是标记基因是否表达 放射性同位素 杂交带）
2+
1.检测转基因生物的染色体DNA上是否插入了目的基因 DNA分子杂交技术。 2.检测 目的基因是否转录出了mRNA 用标记的目的基因作探针与 mRNA杂交。
3.检测目的基因是否翻译成蛋白质 从转基因生物中提取蛋白质 用相应的抗体进行抗原－抗体杂交。 4.有时还需进行 个体生物学水平的鉴定。如 转基因抗虫植物是否出现抗虫性状。 （三）基因工程的应用 ．．．．．．．．．．
1.植物基因工程：抗虫、抗病、抗逆转基因植物，利用转基因改良植物的品质。 2.动物基因工程：提高动物生长速度、改善畜产品品质、用转基因动物生产药物。 3.基因治疗：把正常的外源基因导入病人体内，使该基因表达产物发挥作用。 （四）蛋白质工程的概念 ．．．．．．．．．．．
蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其生物功能的关系作为基础，通过基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质，以满足人类的生产和生活的需求。（基因工程在原则上只能生产自然界已存在的蛋白质）
【专题二·细胞工程】 （一）植物细胞工程 ．．．．．．．．．
1.理论基础（原理）：细胞全能性
全能性表达的难易程度：受精卵＞生殖细胞＞干细胞＞体细胞；植物细胞＞动物细胞 2.植物组织培养技术 （1）过程：高度分化的组织―
脱分化
→薄壁细胞―→愈伤组织―
再分化
→幼根、芽―→小植株
<胡萝卜组织培养：选取形成层（无毒） 培养基上避光培养 分化培养基 胚状体或丛芽） （2）用途：微型繁殖、作物脱毒、制造人工种子、单倍体育种、细胞产物的工厂化生产。 （3）地位：是培育转基因植物、植物体细胞杂交培育植物新品种的最后一道工序。 3.植物体细胞杂交技术
（1）去壁：纤维素酶和果胶酶
（2）诱导融合的方法：物理法包括离心、振动、电刺激等。化学法一般是用聚乙二醇（PEG）作为诱导剂。
（3）意义：克服了远缘杂交不亲和的障碍。
（4）应用：植物的微型繁殖技术（微型繁殖或快速繁殖技术 对分生区，如茎尖进行组织培养获得脱毒苗） 人工种子（以植物组织培养得到的胚状体、不定芽、顶芽和腋芽等为材料经人工薄膜包装得到的种子） 细胞产物的工厂化生产 作物新品种的培育 （二）动物细胞工程 ．．．．．．．．．
1. 动物细胞培养（对分散的单个细胞进行培养）
（1）流程：取动物组织块（动物胚胎或幼龄动物的器官或组织）―
剪碎
→用胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理
分散成单个细胞→制成细胞悬液→转入培养瓶中进行原代培养→贴满瓶壁的细胞（接触抑制）重新用胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理分散成单个细胞继续传代培养。<传代培养细胞可能获得不死性> （4）动物细胞培养需要满足以下条件
①无菌、无毒的环境：培养液应进行无菌处理。通常还要在培养液中添加一定量的抗生素，以防培养过
程中的污染。此外，应定期更换培养液，防止代谢产物积累对细胞自身造成危害。
②合成培养基成分：糖、氨基酸、促生长因子、无机盐、微量元素等。通常需加入血清、血浆等天然成分。
③温度：哺乳动物多是36.5℃＋0.5℃；pH：7.2～7.4。
④气体环境：95%空气和5% CO2。O2是细胞代谢所必需的，CO2的主要作用是维持培养液的pH。 （5）应用：制备病毒疫苗、制备单克隆抗体、检测有毒物质、培养医学研究的各种细胞。 2.动物体细胞核移植技术和克隆动物
（1）哺乳动物核移植可以分为胚胎细胞核移植（比较容易）和体细胞核移植（比较难）。 （2）选用去核卵(母)细胞的原因：卵(母)细胞比较大，容易操作；细胞质多，营养丰富。 （3）体细胞核移植的大致过程是： MII期去核
（4）体细胞核移植技术的应用： ①加速家畜遗传改良进程，促进良畜群繁育 ②保护濒危物种，增大存活数量 ③生产珍贵的医用蛋白 ④作为异种移植的供体 ⑤用于组织器官的移植等。
（5）体细胞核移植技术存在的问题：克隆动物存在着健康问题、表现出遗传和生理缺陷等。 3.动物细胞融合
（1）动物细胞融合也称细胞杂交，是指两个或多个动物细胞结合形成一个细胞的过程。融合后形成的具
有原来两个或多个细胞遗传信息的单核细胞，称为杂交细胞。
（2）动物细胞融合与植物原生质体融合的原理基本相同，诱导动物细胞融合的方法与植物原生质体融合
的方法类似，常用的诱导因素有聚乙二醇、灭活的病毒、电刺激等。
（3）动物细胞融合的意义：克服了远缘杂交的不亲和性，成为研究细胞遗传、细胞免疫、肿瘤和生物新
品种培育的重要手段。
（4）动物细胞融合与植物体细胞杂交的比较： 比较项目 细胞融合的原理 细胞融合的方法 诱导手段 用法 植物体细胞杂交 动物细胞融合 细胞膜的流动性 细胞膜的流动性 去除细胞壁后诱导原生质体融合 使细胞分散后诱导细胞融合 离心、电刺激、振动，克服了远缘杂交的不亲聚乙二醇等试剂诱导 和性，获得杂种植株 除应用植物细胞杂交制备单克隆抗体的技术手段外，再加灭活的病之一 毒诱导
4.单克隆抗体
（1）抗体：一个B淋巴细胞只分泌一种特异性抗体。从血清中分离出的抗体产量低、纯度低、特异性差。
（2）杂交瘤细胞的特点：既能大量繁殖，又能产生专一的抗体。 （3）单克隆抗体的优点：特异性强，灵敏度高，并能大量制备。
（4）单克隆抗体的制备过程： 抗原注入小鼠体内
分离 B淋巴细胞 细胞融合 杂交瘤细胞 细胞培养 选择培养细胞 注入小鼠体内培养 从腹水提取 单克隆抗体 培养基 体外培养 从培养液提取骨髓瘤细胞 （5）单克隆抗体的作用：
① 作为诊断试剂：准确识别各种抗原物质的细微差异，并跟一定抗原发生特异性结合，具有准确、高效、简易、快速的优点。
② 用于治疗疾病和运载药物：主要用于治疗癌症治疗，可制成“生物导弹”，也有少量用于治疗其它疾病。
【专题三·胚胎工程】 （一）精子和卵子的发生
1、精子的发生（睾丸的曲细精管内）
过程：第一阶段 位于曲细精管管壁的精原细胞进行数次有丝分裂产生大量精原细胞，部分精原细胞经过染色体复制和其他物质的合成，进一步形成初级精母细胞。
第二阶段 一个初级精母细进行减数第一次分裂产生两个次级精母细胞，减数第二次分裂产生四个含单倍染色体的精子细胞。
第三阶段 精子变形 细胞核变为精子头的主要部分，高尔基体发育成头部顶体，中心体演变成精子的尾，线粒体聚集在尾的基部形成线粒体鞘，细胞内其它物质浓缩为球状原生质滴，向后移动最后脱落。
2、卵子的发生（雌性胎儿 卵巢内） 过程：第一阶段 雌性胎儿的卵原细胞通过有丝分裂演变为初级卵母细胞，它被卵泡细胞包围，形成卵泡。 雌性动物排卵前后完成减数第一次分裂，减数第二次分裂在精子和卵子结合过程中完成。 两个极体时，说明受精完成。 3、受精（在雌性输卵管内完成） （1）准备阶段：“精子获能”（在动物生殖道发生相应生理变化后，才获得受精能力）之后； 卵子达到减数第二次分裂中期时。
（2）受精阶段：第一阶段 精子穿越放射冠和透明带 获能后的精子与卵子相遇，发生顶体反应，释放顶体酶溶解卵丘细胞之间的物质，形成精子穿越放射冠的道路。精子与透明带接触后，顶体酶将透明带溶出一条孔洞，精子借自身运动穿越透明带，并接触卵细胞膜。精子触及卵细胞膜瞬间，卵子产生透明带反应（防止多精入卵的第一道屏障）
第二阶段 穿过透明带的精子的外膜和卵细胞膜融合，精子入卵，卵子发生卵细胞膜反应（防止多精入卵
的第二道屏障），完成第二次减数分裂并排出第二极体，形成比雄原核略小的雌原核。精子入卵后尾部脱落，原有核膜破裂，形成一个比原来精子核还大的雄原核。 第三阶段 雌、雄原核充分发育后彼此接触，两组核染色体合为一组，形成一个含二倍体的合子（受精卵） 4、动物胚胎发育的基本过程
（1）受精场所是母体的输卵管上段。
（2）卵裂期：在透明带内进行细胞有丝分裂，细胞数量不断增加，但胚胎的总体体积并不增加，或略有减小。
（3）桑椹胚：胚胎细胞数目达到32个左右时，胚胎形成致密的细胞团，形似桑椹。是全能细胞。 （4）囊胚：特点：细胞开始出现分化（该时期细胞的全能性仍比较高）。聚集在胚胎一端个体较大的细胞称为内细胞团，将来发育成胎儿的各种组织。沿透明带内壁扩展和排列的、个体较小的细胞称为滋养层细胞，将来发育成胎膜和胎盘。中间含有液体的空腔称为囊胚腔。囊胚进一步扩大导致透明带破裂，胚胎从其中伸展出来，这一过程称为孵化。
（5）原肠胚：内细胞团表层细胞形成外胚层，下方细胞形成内胚层，外胚层和内胚层中间的一层细胞称为中胚层。由内胚层包裹的囊腔称为原肠腔。 表皮及其附属结构 外胚层 神经系统 内细胞团――→原肠胚 各种腺体 内胚层 消化系统
受精卵→卵裂期→桑葚胚→囊胚 中胚层―→剩下的所有系统、骨骼等 原肠腔 滋养层细胞→胎膜、胎盘 囊胚腔（最后脱落） （二）胚胎工程的应用
1.体外受精（试管动物技术）和胚胎的早期培养 (1)卵母细胞的采集和培养：
主要方法：用促性腺激素处理，使其排出更多的卵子，然后，从输卵管中冲取卵子，直接与获能的精子在体外受精。第二种方法：从刚屠宰母畜的卵巢中采集卵母细胞；第三种方法是借助超声波探测仪、腹腔镜等直接从活体动物的卵巢中吸取卵母细胞。采集的卵母细胞，都要在体外经人工培养成熟后，才能与获能的精子受精。
(2) 精子的采集和获能：①采集：假阴道法、手握法和电刺激等 ②获能：在体外受精前，要对精子进行获能处理（培养法或化学诱导法）。
(3) 受精：获能的精子和培养成熟的卵细胞在获能溶液或专用的受精溶液中完成受精过程。
(4)胚胎的早期培养：精子与卵子在体外受精后，应将受精卵移入发育培养液中继续培养，以检查受精状况和受精卵的发育能力。培养液成分较复杂，除一些无机盐和有机盐外，还需添加维生素、激素、氨基酸、核苷酸等营养成分，以及血清等物质。当胚胎发育到适宜的阶段时，可将其取出向受体移植或冷冻保存。不同动物胚胎移植的时间不同。(牛、羊一般要培育到桑椹胚或囊胚阶段才能进行移植，小鼠、家兔等实验动物可在更早的阶段移植，人的体外受精胚胎可在8~16个细胞阶段移植。) 2.胚胎移植
(1)胚胎移植是指将雌性动物的早期胚胎，或者通过体外受精及其它方式得到的胚胎，移植到同种的、生理状态相同的其它雌性动物的体内，使之继续发育为新个体的技术。其中提供胚胎的个体称为“供体”，接受胚胎的个体称为“受体”。（供体为优良品种，作为受体的雌性动物应为常见或存量大的品种。）
地位：如转基因、核移植，或体外受精等任何一项胚胎工程技术所生产的胚胎，都必须经过胚胎移植技术才能获得后代，是胚胎工程的最后一道“工序”。
(2) 胚胎移植的意义：大大缩短了供体本身的繁殖周期，充分发挥雌性优良个体的繁殖能力。
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