凝胶电泳是用来将DNA分子混合物根据它们的长度分开的技术(图D.1)。DNA分子的磷酸二酯键上带有负电荷,在电场作用下会在凝胶中发生移动。凝胶是一团密度较大但有孔的聚合物,DNA分子可以从孔中穿过。较小的分子比大分子更容易进入这些孔;结果,一个DNA分子在凝胶中的移动速度直接与它的大小有关。
在凝胶被‘跑’了一段时间以后,每种不同长度的DNA分子将在凝胶上占据不同的位置,呈现出不同的条带。甚至可以制备出很精细的凝胶用于分开长度只差一个碱基对的DNA分子。注意,凝胶电泳不能根据序列区分分子。具有相同长度但序列不同的两个分子将出现在凝胶的同一个位置。凝胶电泳也常用于确定某种特殊的DNA分子是否出现在某个混合物中。通常根据分子的大小就足以鉴定在凝胶上是否有这一特殊分子。凝胶用一种化学物质将DNA染上颜色,使所有条带都清楚易见。同时,在凝胶的平行泳道上跑一套已知大小的DNA分子。通过比较实验DNA的条带与已知大小DNA的条带,就可以很好地估计实验DNA 分子的大小。
Southern印迹法。探针与互补序列条带结合而让它能被看到。有时甚至在不知道实验DNA分子大小的情况下也需要检查某种特殊的DNA分子是否在凝胶上。这时,需要采用称为Southern印迹法的技术(图D.2)。先制备与感兴趣的DNA分子互补的称为‘探针’的DNA小片段,探针只能与那个分子结合。之后使探针带上放射性或荧光标记。然后将它们与凝胶(或凝胶的印迹)混合。如果它们能与凝胶上的某种DNA分子结合,那么这一DNA出现的地方会由于探针上的放射性或荧光而被看到。Southern印迹法也用在许多基因出现在凝胶中仅靠分子大小不能确定某种特殊基因是否存在的情况下,因为其它基因可能具有相同的大小。聚合酶链式反应
(PCR)聚合酶链式反应是用来拷贝DNA分子特殊区域的技术(图D.3)。与细胞中的正常复制一样, PCR在合成中需要依靠DNA聚合酶和脱氧核糖核苷酸。但是,在正常复制中用到的大多数其它酶被PCR 仪器的功能和其它人造分子取代。将各种成分的混合物(包括DNA分子)放进能控制温度的仪器里。PCR 仪先升高混合物的
温度,将双链DNA变性成为单链。这实际上模仿了解旋酶的功能。DNA聚合酶能够使用这些单链为模板进行合成。但在它开始合成前,必须有引物出现在DNA上。在PCR中,引物是人工制备的DNA寡聚物,它们也被加到了反应混合物中。它们不是RNA,也不是由引发酶产生的。PCR仪将温度降下来以便D在完成一轮合成后,从最初的一个模板分子得到了两个DNA分子。现在另一个循环开始了。PCR仪又一次加热使DNA分子变性──包括新合成的分子──然后降温使引物退火并进行DNA合成。从前一轮PCR得到的两个分子出发可以产生四个新的分子。下一轮合成中,这四个分子将被用来产生8个新的分子。这样,随着每一轮PCR的进行,DNA分子的数量呈指数式增长。经过几十轮后,可以产生几十亿个拷贝。NA引物与DNA模板杂交或‘退火’。接着,DNA聚合酶便能够从引物PCR的一个有用之处是它可以用来拷贝模板分子的特殊区域,而不是整个模板分子(图D.4)。将要被复制的区域由根据模板上的退火位点设计的人工引物决定。一个引物决定了需要拷贝区域的一个末端,另一个引物决定了另一个末端。每个引物总是与一个位点结合并且只与模板DNA的一条链结合。应用PCR可以产生细胞基因组中任何基因的许多拷贝。开始拷贝每一条链了。PCR反应经常会产生一些不希望出现的副产物。凝胶电泳在将需要的产物从副产物中分离出来方面相当有用。
除了能被拷贝和分离外,在实验室里也能对DNA分子进行重排。例如,可以使用常规技术对DNA的整个区域进行移动、删除和重新连接。
限制性内切核酸酶使重组DNA技术成为可能,这是一些能在准确的位置切割DNA分子的蛋白质(图D.5)。通常,它们的目标序列具有回文结构,即从反向读和从正向读它们都是一样的。这种酶在两条链上相距几个碱基各产生一个单链切口。这样就得到了两个末端,每个末端各有一条单链比另一条略长。共有几百种不同的限制酶,每一种识别不同的位点。不过,每次一种特殊的限制酶切割DNA分子时,它产生的都是完全相同的末端。
限制酶产生的交错切口常被称为粘性末端。这是因为一个末端可以与另一个互补的末端结合,把两个分子粘合在一起。事实上,在DNA分子被限制酶切开后,两
个互补的末端常常继续粘合在一起。但它们并不是非这样不可。如果另外一个DNA分子也用相同的酶切割,就会得到相同的粘性末端。这些末端与从第一个分子得到的粘性末端是一样的,也能结合在一起(图D.6)。
分子克隆的一般过程(质粒大小未按比例画)为了获得原始基因的准确拷贝,需要将它放入活细胞(通常是大肠杆菌)中,活细胞具有准确地拷贝基因的能力(很少出错)。PCR拷贝得到的DNA是线状的,如果放入大肠杆菌细胞的话会被降解掉。因此,PCR产物必须先插入到质粒中,质粒是环状DNA片段,能起到人工染色体的作用。将线状DNA片段放入环状质粒需要采用上面讨论过的DNA重组技术。PCR产物和质粒均用相同的限制酶在两个位置进行切割,在基因片段的两端产生粘性末端,同时在质粒上打开一个缺口以便基因片段进入。由于酶切后基因和质粒具有相同的粘性末端,所以它们能结合在一起。之后由连接酶将它们共价连接起来。一旦从PCR来的基因片段被插入到质粒上,质粒必须被送入大肠杆菌细胞中去。这种将DNA送入细胞的过程称为转化。通常,将质粒与一个大肠杆菌细胞群体混合,之后给一个强刺激(如热刺激或电刺激)使细胞产生短暂的通透性,让DNA这样的大分子能够进入。为了区别已经摄入了质粒和没有摄入质粒的细胞,通常将质粒设计成含有抗生素抗性的基因。在转化之后,将细胞涂到含有抗生素的培养基上。只有那些摄入了质粒的细胞才能在含有抗生素的培养基上生长。最后得到的是一块含有大肠杆菌斑点(称为菌落)的平板。一个菌落中的所有大肠杆菌细胞是完全一样的,因为它们都来自于一个细胞。在需要这一基因的任何时候都可以将这些菌落取出放到营养丰富的环境中让它们生长。之后可以很容易地从细胞中提取含有目的基因的质粒拷贝。由于是选择一个特别的菌落去生长和提取基因,检查一下那一菌落里基因的质量是明智的。回想一下,PCR在复制时常常会出错,连接到某一质粒上的基因拷贝或许带有一个突变。基因的完整性可以通过提取少量基因并对其测序而进行鉴定。测出的序列应该与基因的已知序列相同。
柱层析是最常见的蛋白质纯化方法,能够在上面提到的所有三种情况下应用(图D.10a)。在柱层析中,让蛋白质混合物通过一根层析柱。某种蛋白质通过层析
凝胶电泳是用来将DNA分子混合物根据它们的长度分开的技术
