肉鸡MSMO1基因的克隆及表达模式分析
徐凤华，宋 琪，邢晋祎*，孙炜涵
【摘 要】【目的】克隆肉鸡MSMO1(Methylsterol monooxygenase 1)基因序列，并分析其表达模式，为研究MSMO1基因的功能奠定基础。 【方法】利用RT-PCR技术克隆肉鸡MSMO1基因，采用生物信息学方法分析其蛋白质结构，并用定量PCR技术检测MSMO1基因在组织间的表达差异。【结果】肉鸡 MSMO1基因的cDNA序列长度为1404 bp，编码296个氨基酸；MSMO1蛋白145～274 位氨基酸序列残基存在FA-hydroxylase结构域，为亲水蛋白。进化树分析表明，肉鸡MSMO1氨基酸序列与日本鹌鹑和鹦鹉的MSMO1分子亲缘关系较近；二级结构主要以α-螺旋(41.89 %)为主。组织表达水平结果显示，在8种组织中均检测到MSMO1基因的表达，且在肝脏中的表达水平极显著高于其它7种组织中的表达水平(P<0.01)，在脾脏和胸肌中的表达水平极显著低于在肺脏和肝脏中的表达水平(P<0.01)。【结论】本结果将为进一步研究MSMO1基因的结构和功能奠定基础。 【期刊名称】西南农业学报 【年(卷),期】2017(030)012 【总页数】5
【关键词】肉鸡；MSMO1基因；克隆；表达模式
【研究意义】甲基固醇单加氧酶1(Methylsterol monooxygenase 1，MSMO1)，又名固醇-C4-甲基氧化酶样基因(sterol-C4-methyloxidase-like，SC4MOL)，MSMO1基因突变能引起银屑病样尿布皮炎、关节痛、先天性白内障和发育迟缓等病人的常染色体隐性综合症，该基因编码固醇-C4-甲基氧化
酶蛋白(sterol-C4-methyl oxidase)，定位在内质网膜上，在胆固醇生物合成途径中催化C4-甲基固醇去甲基化[1-3]。因此，MSMO1基因通过调节人体能量代谢、肥胖和血脂异常，从而在脂类的生物合成中起着关键作用[4-6]，而且对细胞的增殖和免疫调节起着调控作用[1]。【前人研究进展】目前，人MSMO1基因被定位在4q32-q34[7]，对MSMO1基因的研究主要集中在人类胆固醇合成和脂肪代谢方面，在畜禽方面的研究尚未见报道，尽管在GenBank数据库上已有原鸡的MSMO1基因序列，但肉鸡作为易于积累脂肪的动物，其MSMO1基因功能和结构尚不明了。【本研究切入点】本研究以肉鸡为研究对象，克隆MSMOS1基因序列，分析MSMOS1基因序列特征及表达谱。【拟解决的关键问题】研究结果可为进一步研究肉鸡MSMO1基因的结构和功能奠定基础。
1 材料与方法
1.1 试验动物与样品采集
随机挑选外形体貌和体重相近的42日龄肉鸡5只。屠宰前使其空腹12 h，自由饮水。屠宰后采集胸肌、腿肌、肾脏、心脏、脾脏、肺脏、腹脂和肝脏，切割成0.5～1.0 g小块，液氮速冻，-80 ℃保存，用于后续提取RNA。 1.2 主要仪器设备
高速冷冻离心机(Eppendorf)、凝胶成像系统、微量移液器(Eppendorf)、定量PCR仪(Roche)、高低温振荡培养箱、琼脂糖凝胶电泳系统、超低温冰箱、超纯水机等。 1.3 主要试剂
Trizol Reagent和RNase Inhibitor(Invitrogen公司)、M-MLV反转录酶
(Promega公司)、pMD19-T vector、LA Taq聚合酶、EcoRⅠ、Hind Ⅲ限制性内切酶、SYBR? Premix Ex TaqTM II(宝生物工程(大连)有限公司)。 1.4 总RNA提取和cDNA合成
利用Trizol提取总RNA，并检测RNA的质量。用Promega公司的M-MLV反转录试剂盒制备cDNA。
1.5 鸡MSMO1基因的PCR扩增和测序
依据GeneBank上公布的原鸡MSMO1(NM_001006438)基因序列，用软件Primer premier 6.0设计引物MSMO1-f和MSMO1-r(表1)。以cDNA为模板，按照如下反应体系进行PCR扩增：10×PCR反应缓冲液(Mg2+ plus)2.5 μl、模版cDNA 1.0 μl(约50～100 ng)、4种dNTP 混合物(每种2.5 mmol/L) 2.0 μl、上下游引物 (20 μmol/μl) 各0.5 μl、LA Taq聚合酶0.2 μl (1 unit)、灭菌水加至25 μl，混合后稍离心。PCR反应程序：94 ℃预变性 5 min；94 ℃变性 30 s；55 ℃ 退火 30 s；72 ℃延伸 50 s；72 ℃延伸5 min。
把PCR产物进行纯化回收。将pMD19-T vector与回收的PCR产物相连接，4 ℃放置过夜。制备感受态细胞，然后挑取平板上白斑单菌落，放置于含有3 mL LB培养液，3 μl Amp(质量浓度为100 μg/mL)的试管中，37 ℃恒温摇床培养过夜，提取质粒。用Hind Ⅲ和EcoRⅠ双酶切鉴定阳性克隆，由生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。 1.6 MSMO1基因的生物信息学分析
将测序获得的序列用 NCBI的ORF Finder程序分析MSMO1基因的开放阅读框，预测氨基酸序列，用DNAMAN软件比较与其它动物MSMO1的氨基酸序列一致性；采用Blast程序分析其蛋白保守结构域；用软件MEGA 7.0构建
肉鸡MSMO1基因的克隆及表达模式分析
