杆菌。
3. 基因鉴定：16SrRNA分析
为了进一步确证生理生化鉴定的可靠性，还可以补充进行基因序列分析。16SrRNA分析是目前比较常用的分析手段。采用基因组DNA提纯试剂盒提取MAA139基因组DNA，并以此为模版，选择细菌16SrRNA基因特性引物进行PCR扩增，并对扩增产物提纯回收，测定16SrRNA序列。目前这种试验在实验设备比较完善的生物研究所实验室都能进行。其结果证实MA139是枯草芽孢杆菌。
五、芽孢杆菌的安全性评价
确证了芽孢杆菌的特性，接下来需要考虑其安全性问题。 益生菌菌种的安全性是研究开发中必须关注的问题。这其中包括：①生产菌种必须属于官方公布允许使用的饲用微生物菌种；②使用的菌种本身必须无毒无害，不会产生任何毒素；③不存在耐药性的质粒或者耐药性基因不存在转移的问题。以下还以枯草芽孢杆菌MA139为例，简要说明进行芽孢杆菌安全性评价的方法。
安全性试验的靶动物一般都选用老鼠，具体可参考如下方法： 选择12只体重基本一致的SD大鼠（Sprague-Dawley,SD）,初始体重在200~220g比较适合，雌雄各半，分为两个实验组，一组用5mL芽孢菌悬液（108cfu/mL）注射到大鼠腹腔中；另一组用5mL生理盐水注射大鼠作为试验对照。注射前禁食
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6h。灌服后观察其中毒症状，看是否出现呼吸困难、抽搐、肢体麻痹等。观察时间为1周。
灌服MA139的芽孢后，所有大鼠均无明显临床症状，无一死亡，试验组和对照组间，没有明显差异，证明MA139安全无毒。
六、抗生素敏感性试验
在实际生产中，绝大多数的动物饲料都添加了抗生素，动物的肠道经常处于抗生素压力之下，这种选择性压力更容易促进细菌间耐药性基因的传递和转移。所以在选择菌种的时候，对于哪些携带有可转移耐药性基因的质粒的细菌，从长远考虑，在生产实际中一定不要采用。在抗生素尚未完全被益生素类的绿色添加剂完全取代的时候，抗生素有时会与益生素联合添加，因而在菌株筛选的时候，会人为地筛选出对抗生素具有抗性的微生物应用于实际，这种短期行为也加大了耐药性细菌扩散和转移的可能。所以，为了确保芽孢杆菌的使用效果，需要对抗生素的敏感性进行检验。
研究结果显示（表2-10，图2-11），MA139对试验的十种抗生素的敏感性不一样，对杆菌肽锌不敏感，对其它的抗生素都有一定的敏感性，对杆菌肽锌的耐药性可能与产生杆菌肽的细菌具有
一定的同源性。
图2-11 MA139对抗生素的敏感性
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表2-10 MA139对抗生素的敏感性
抗生素名称
大观霉素[Spectinomycin(SPT)] 杆菌肽[Bacitracin(B)] 卡那霉素[Kanamycin(K)] 多黏菌素B[PolymyxinB(PB)] 呋喃唑酮[Furazolidone(FR)] 红霉素[Erythromycin(E)] 氯霉素[Chloramphenicol(C)] 四环素[Tetracycline(TE)] 万古霉素[Vancomycin(VA)] 利福平[Rifampin(RA)] 注：“+”为敏感；“-”为不敏感。
浓度 100μg/片
0.04IU/片 30μg/片 300μg/片 300μg/片 15μg/片 30μg/片 30μg/片 30μg/片 5μg/片
抑菌圈直径/mm
26.5 0.0 24.1 12.8 21.3 24.0 28.7 17.7 19.2 27.8
结果判定
+ - + + + + + + + +
从上述分析可以发现，芽孢杆菌的分离筛选远比乳酸菌复杂，特别是在安全稳定性方面的检验更是极为繁琐。但是这些都是必须完成的工作，在实际生产过程中，任何步骤出现差错都有可能导致很严重的后果。
第三节 发酵饲料生产菌种的制备和保存
在获得了饲料生产菌种以后，需要对生产菌种进行扩大培养和保存，在生产中称为制种。生产企业的规模不同，准备生产菌种的方式也有差别。大型生产企业由于用量比较大，往往自己制种，现生产现用。生产规模比较小的企业倾向于购买菌种，或者部分购买，部分自己制备。
在前期的叙述中，我们已经知道，发酵饲料的生产菌种主要是乳酸菌、酵母菌和芽孢杆菌。现在就针对这三种微生物的扩大培养和干燥保存进行论述。
一、乳酸菌的培养
乳酸菌是最常用的有益菌，一般都是厌氧菌，很难制成干粉，
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最好现培养现用。
乳酸菌培养最简便、最成熟的方式类似酸奶的发酵。在无抗生素污染的牛奶中加入6.0%~8.0%的糖，经过消毒，冷却至37℃左右，在无菌条件下接种、厌氧培养，就可以获得比较理想的培养物。以下是在实际生产中采用的乳酸菌扩大培养方法。
选取无抗生素污染的纯牛奶10L，加入600~800g白砂糖（也可用红糖代替），加热至60~70℃，直至蔗糖完全溶解，然后分装在500mL三角瓶中，用棉花塞塞紧，外包牛皮纸。在110℃左右消毒灭菌10min，冷却至37℃左右，接种乳酸菌，这样不仅可以提高糖酸转化效率，而且乳酸菌培养过程容易控制气压。
在36~40℃恒温培养20~24h，就可以用于后续的发酵饲料扩大接种，乳酸菌培养液与发酵饲料的接种比例为0.2%左右。
需要强调的是一定要用无抗生素污染的牛奶。乳酸菌一般对抗生素很敏感，溶液中只要有5mg/kg的抗生素就会对乳酸的生长繁殖起到明显的抑制作用，基本不能获得合格的培养物。如果没有合格的无抗生素污染牛奶，可以用无药物污染的豆粕粉。豆粕经过浸泡、磨浆以后可以替代牛奶，豆粕干物质在溶液中的含量为8.0%左右，类似于豆浆，其后续的补糖和接种发酵过程与牛奶发酵过程类似。也可以用无抗生素污染的奶粉（如新西兰奶粉）加水调浆（加水量是奶粉分量的8倍左右），恢复成原始牛奶的营养浓度。
二、乳酸菌培养液的脱水干燥
传统的微生物培养液的干燥都是设法先除去培养液中的自由
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水。但是对乳酸菌培养液来说，除水是比较困难的单元操作。乳酸菌对热和氧气都很敏感，即使是高浓度的乳酸菌培养液，其含水量一般都超过90%，干物质的含量不超过10%，除水通常需要较长的时间。对于厌氧的乳酸菌来说，与空气接触时间越长，活力损失也越大。
采用常规的气流干燥，乳酸菌的活性损失一般都要超过90%以上。即使采用瞬时喷雾干燥，活力损失也要超过85%。脱水后的制剂，在20℃条件下，在空气中暴露24h，活力损失就会达到40%以上，给实际推广造成很大困难。
近年来，世界各地的畜牧科研工作者在活性乳酸菌的干燥保存方面进行了大量研究，提出了很多高科技的方法，其中比较常用的方法是抽真空冷冻干燥和包埋造粒。但因成本造价高昂，并不适合工业化生产。下面叙述是比较实用的乳酸菌脱水干燥方法：
一般普通的大麦、小麦和玉米等农副产品的含水量都在14%左右，经过100℃气流干燥以后，可以比较简单地把水份降低到6%左右。然后再用这些经过干燥的载体以大比例（10倍以上）与乳酸绝培养液混合，使混合物的水份含量为11%~20%，从而使乳酸菌处于休眠状态，不易失活。干燥冷却后的载体可以迅速的吸附培养液中的游离水，然后在真空包装。实验表明，此方法保存的乳酸菌，在室温条件下保存3个月，乳酸菌的活力可以保存50%以上，保存6个月时，乳酸菌的活力保存在40%左右。此方法简便实用，成本低廉、质量稳定，保质期长，且活性乳酸菌的
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发酵饲料生产工艺与应用
