际生产的乳酸菌必须来源于健康动物的消化道，最好是在发生了瘟疫的养殖场而幸存的畜禽。发生瘟疫的养殖场，动物大比例死亡，幸存的畜禽虽少，但是生命力很顽强，是极好的生产菌种采集样本。
以下以筛选符合生羊健康养殖需要的生物饲料用乳酸菌为例，叙述样品的采集和乳酸菌的分离。在实验室中对生羊进行攻毒试验，在饲料中不断加大大肠杆菌（实验用E.ColiK88,这是一种常见的攻毒试验用大肠杆菌）的用量，以检验生羊的抵抗力。经过5~7d的试验，生羊的健康水平越来越差。我们选择其中两头最健康的生羊进行屠宰，在无菌环境中提取它的胃液、小肠液和大肠液，迅速保存在无菌生理盐水（NaCl的浓度为0.9%）中。 目标乳酸菌一般都是厌氧菌，为了确保乳酸菌的活力，需要尽可能降低生理盐水的氧化还原电位。最简便的方法是在溶液中加入适量的半胱氨酸，半胱氨酸有巯基（—SH），有很好的还原力，可以消除溶液中残余的氧。
二、 乳酸菌的分离纯化
样品中的目标乳酸菌含量一般都不是很高，而且还污染了其他杂菌。为了提高筛选成功的几率，在样品进行分离纯化以前，可以对样品进行选择性增殖培养，以增加目标乳酸菌的含量。 样品的增殖培养比较简单，把经过适当处理的样品接种到适于目标乳酸菌生长的培养基中。比较常用的是牛奶增殖培养液，在无抗生素牛奶中补充6%~8%的蔗糖，高温消毒、冷却，然后用氮气或者二氧化碳驱除溶液中残留的空气，再接入适量采
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集的样品，在30~32℃条件下厌氧培养10~24h。如果样品中的目标乳酸菌含量比较低，可以适当延长培养时间。 样品经过预增殖培养以后，目标乳酸菌含量明显提高，可以进入下一步分离纯化操作。
乳酸菌分离培养基通常采用MRS琼脂培养基，其营养组成与pH如下：蛋白胨：5.0g/L；牛肉浸膏：4.0g/L；酵母膏：2.0g/L；葡萄糖：12.0g/L；玉米浆：10.0mL;司盘80：1ml;磷酸氢二钾：1.0g/L；三水乙酸钠：3.0g/L；柠檬酸三铵：1.0g/L；硫酸镁：0.1g/L；硫酸锰：0.03g/L；琼脂：18.0g/L。pH6.2±0.2。 加热溶解上述各组分，配制成均匀的溶液，分装在厌氧滚管中（每个管中加5~6mL）。在115℃消毒杀菌30min。冷却至50℃左右后，在冰水中滚动滚管，使固体培养基均匀凝固在管壁上。 为了指示培养基的氧化还原电位，可以在培养基中加入极少量的刃天青（一种显色剂），浓度0.02%就足够了。在低电位时培养基显蓝色，随氧化还原电位不断上升，培养基的颜色逐步由蓝转为浅蓝、粉红、红色。如果培养基的颜色转成粉红就基本不合格了。同增殖培养过程一样，在MRS分离培养基中加入适量的半胱氨酸可以在一定时间内维持环境的低电位。 分离纯化培养基准备好以后，就可以进行目标乳酸菌的分离操作了。
在超净工作台上（或者其他无菌环境中），对经过增殖培养的样品进行梯度稀释，稀释液还是用无菌的生理盐水，把稀释后的样品接种到厌氧滚管中，密封（滚管有密封盖）。在30~32℃条
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件下培养1~2d。
为了提高筛选几率，可以同时做多个稀释梯度样品的培养。如果两天以后不出现理想的菌落，可以再延长培养时间。 虽然乳酸菌的最适宜生长温度是37~40℃，但是在分离筛选过程中，培养温度应适当调低，以降低其生长速度，这样菌落之间的差异可以更明晰，也更有利于挑选理想的菌种。 经过上述分离操作，我们获得了5株乳酸菌，它们分别是： 1.来源于羊胃的格氏乳杆菌（Lactobacillus gasseri）; 2.来源于十二指肠的罗伊氏乳杆菌（Lactobacillus reuteri）; 3.来源于小肠的屎肠球菌（Enterococcus faecium）; 4.来源于空肠的嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）; 5.来源于结肠的发酵乳杆菌（Lactobacillus fermentium）。
三、发酵力和耐酸稳定性分析
为了后续生产应用的需要，我们对分离获得的乳酸菌进行发酵力测定和耐酸稳定性试验。发酵力测定比较简单，主要测定其乳酸菌的产量，具体方法如下：
接种分离获得的细菌纯种于试管培养液中，30~32℃恒温培养12h，然后再扩大接种到牛奶瓶中，30~32℃恒温培养6h，测定乳酸含量。
在乳酸发酵的过程中乳酸通常以乳酸钙的形式存在， 通过去除发酵液中的葡萄糖和蛋白质，并加入适当浓度硫酸酸化，钙离子
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转化成难溶的硫酸钙沉淀，使溶解度不高的乳酸钙全部转变为乳酸。乳酸在铜离子的催化下，与浓硫酸作用生成乙醛，乙醛能与对羟基联苯作用生成在 565 nm 处有特征吸收的紫色物质。在一定浓度范围内，乳酸含量与 565 nm 处波长吸光度呈线性关系，因此，可以通过测定 565 nm 处的吸光度来测定乳酸的含量。
实验室乳酸含量的测定
一、原 理
稀乳酸在 浓硫酸作用下加热，可以变成乙醛。乙醛与羟基联苯作用可以生成红色的复合物，在565nm条件下比色测定，可以确定乳酸含量。 二、试 剂
1. 4.0%硫酸铜溶液
将4g无水硫酸铜溶解在水溶液中，定容至100ml。 2. 羟基联苯（C6H5·C6H4OH）溶液
将1g羟基联苯溶解于100ml浓度为0.08mol/L的NaOH溶液中，储存在褐色试剂瓶中。 3.乳酸标准液
将280mg纯乳酸锂溶于水中，配成250mL溶液，其乳酸浓度为1mg/mL，存放于4℃冰箱中。在做标准曲线时将溶液稀释10倍，使乳酸含量为100μg/mL。在分别取1，2，3，4，5，6mL稀释液，稀释配制成1，2，3，4，5，6μg/mL乳酸标准液。 4.浓硫酸溶液
在比色管中分别加入1mL乳酸标准液和0.05mL硫酸铜溶液，然
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后加入6mL浓硫酸，放置5min，冷却至20℃以下。 三、标准曲线的制备和乳酸含量的测定
在上述比色管中加入0.05mL羟基联苯溶液，混合均匀，在室温下放置6~8h，过夜。在565nm波长下进行比色测定，绘制标准曲线。
（1） 最大吸收波长的确定
乳酸发酵液样品显色后，表明，最大吸收波长为 565 nm。
图2-1最大吸收波长的确定
（2） 最佳显色条件的选择
结果表明，氢氧化钙和浓硫酸的加入量对显色反应影响显著，其余因素的作用不显著，最佳显色条件为A2B3C2D1E1F3，即氢氧化钙 0.05g，20%硫酸铜 0.8 ml，浓硫酸 6 ml，对羟基联苯 0.125 ml，静置时间 15 min，加热显色时间 5 min。 （3） 乳酸标准曲线的制备
乳酸标准应用液浓度在 10~80 μg/ml范围内与吸光度值基本呈
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发酵饲料生产工艺与应用
