石蜡切片免疫组化及免疫荧光染色方法
１、组织得采集、固定与保存: 采取组织后，
方法一:4％多聚甲醛(４％PＦA）4?C 固定１小时（根据组织大小与致密程度调整固定时间）或过夜
方法二：采用bｏｕｉn’s固定RT 2h(6—8d teｓis)or RT 过夜(成年 tesis)
ＰＢS缓冲液洗三次,每次5min,4?C保存于７0%乙醇中。 ２、组织得包埋、切片、展片及保存::
固定后得样品经梯度乙醇脱水、二甲苯透明，52—54?C石蜡包埋,常规切片，切片厚4 —10?m，贴于处理过得干净载玻片上,3７?C烤片过夜,之后收集于载片盒中，RT密封保存。 石蜡包埋：
保存于4?C 7０%乙醇中得组织样品
?
80％乙醇 15 min
?
95%乙醇 15 mｉn
?
１0０%乙醇 15mｉｎ ? ２
?
1/２乙醇1/2二甲苯 15 mｉn
?
二甲苯透明 ５－10 ｍiｎ
?
1／2二甲苯1/2石蜡 30 min
?
石蜡（1) １、5hr
?
石蜡（2) 1、5-2、5hr
? 石蜡（3) 包埋
? RT保存
3、石蜡组织切片得免疫组化方法:
密封保存于RT得组织切片
?
二甲苯(1) 20 mｉn
?
二甲苯（2） 20 ｍin
? 100%乙醇 20ｍin
?
9５％乙醇 1０ min
?
80%乙醇 １0 mｉn
?
通风橱晾干，阻水笔在组织周围画圈
?
切片在PBＳ中浸泡 5 min*２
?
0、4％Tritonｘ RT 10 min
?
切片在PBＳ中浸泡 5 ｍin*3
3％H2O2 RT 10min
切片在ＰＢS中浸泡 5 min＊3
0、25%胰酶 ＲT １０min 切片在PＢS中浸泡 5 min＊3
Blockiｎｇ bufｆer(３%BSA+５%NGＳ+0、2％Triｔonx-１00 ｉｎ
ｆfer
1h
３%H2O２）
可停止。
BS) ＲT 6０ｍin
倾去blockinｇ buffer，勿洗 一抗４?C oveｒnight iｎ blockｉnｇ ｂu 取出切片复温１ｈ，切片在PBＳ中浸泡 5 min＊3 二抗in blocｋinｇ ｂuｆfeｒ ＧAR1:20０ (GＡM1：100),RT 切片在ＰBＳ中浸泡 5 min*3 ＤAB显色5—1０miｎ(5０微升A+50微升B+90０微升PBS+5微升 如果就是增强型DＡB只要1ｍiｎ即可。 切片浸入PBＳ终止显色，HE衬染1ｓ, 玻片架放入泡沫盒,流水冲洗1５mｉn，肉眼瞧到淡淡得紫色即 若颜色太深，可用０、1—0、5%盐酸乙醇分色1～2秒
Ｐ
钟（或更久）
脱水85%乙醇 5 min
?
95％乙醇 5 min
?
无水乙醇 ５ ｍin
?
无水乙醇 5ｍｉn
?
二甲苯(1） 1０min
?
二甲苯(2） 10min
?
中性树胶封片，室温干燥保存
4、石蜡组织切片得免疫荧光方法：
密封保存于RＴ得组织切片
? 二甲苯(1） 20 min
?
二甲苯(2） ２0 min
?
1０0%乙醇 20miｎ
? 95％乙醇 １0 min
?
8０％乙醇 10 min
?
通风橱晾干,阻水笔在组织周围画圈
?
切片在PBS中浸泡 5 min*2
?
0、4％Ｔritｏｎx RT 10 ｍin
?
切片在ＰBS中浸泡 5 ｍiｎ＊3 切片在ＰＢS中浸泡 5 ｍin*3
0、２5%胰酶 RT 10miｎ
切片在ＰBS中浸泡 ５ miｎ*３ Bｌｏcking buｆｆeｒ（3%BSＡ＋5％NGS+0、2％Tritonx-１０0 in PBS) RT 60mｉn
倾去bloｃking buffｅr，勿洗
一抗4?C ｏvｅrnight ｉn ｂlocｋiｎｇ buffer
取出切片复温1ｈ,切片在PBＳ中浸泡 ５ ｍin＊3
荧光二抗in ｂlockinｇ ｂｕfｆｅr GAＲ—ｃｙ3 1：1000,GAM-4８8 1：100０RT 1ｈ
DＡPＩ（1:1０0０请根据二抗说明稀释二抗) 切片在PBS中浸泡 5 min*3
moil封片，避光4?C保存
石蜡切片免疫组化及免疫荧光染色方法
