实验二 质粒DNA的琼脂糖凝胶电泳
一、实验目的
掌握琼脂糖凝胶电泳的原理和方法，初步估算双链线性未知DNA分子的大小。
学习质粒的琼脂糖凝胶电泳方法。
二、实验原理
琼脂糖是从琼脂中分离制备的链状多糖，是由β－D－吡喃型半乳糖和3,6－脱水－β－L－吡喃型半乳糖以糖苷键相互交替（1,3－1,4）连接而成的一种线性半乳多聚糖，它能够在热的溶剂中溶化并在冷却过程中形成凝胶。许多琼脂糖分子依靠氢键及其他力的作用使其互相盘绕形成绳状琼脂糖束，构成大网孔型凝胶。该物质对尿素和盐酸胍等破坏氢键的试剂有较强的抵抗力。在 pH4.0－9.0的缓冲液中是稳定的。由于其分子上无带电基团，在缓冲液离子强度大于 0.05 时，对蛋白质无吸附作用，也无电渗现象，因而分辨率和重现性均较好，是一种优良的电泳材料。在一定浓度的琼脂糖凝胶介质中，如 DNA 分子的电泳迁移率与其分子量、分子构型和所用缓冲液对迁移率相关。当凝胶浓度太高时，凝胶孔径变小，环状 DNA 不能进入胶中，相对迁移率为零，而同等大小的线性 DNA 可以按长轴方向前移，相对迁移率大于零。
DNA分子在电场中会向正极方向移动，不同长度的DNA由于受到凝胶介质的阻力不同，表现为不同的迁移率而被分开。
三、仪器设备、材料与试剂
仪器设备
电泳仪 电炉 凝胶成像系统 电子天平 pH计 量筒（10 mL，100 mL，500 mL，1 000 mL）烧杯（50 mL，100 mL，500 mL，1 000 mL）一次性手套 无粉乳胶手套（光明牌，大、中、小三种号码）玻璃棒 称量勺 微量移液器（1 000 μL，200 μL，20 μL）灭菌的1.5 mL离心管（eppendorf管） 灭菌吸头（1 000 μL，200 μL，20 μL），相应的吸头盒 吸水纸 100mL三角瓶
材料：
碱法提取获得的质粒DNA样品，标准相对分子量DNA（Marker）
四、试剂配制：
● 50×TAE电泳缓冲液母液：50ml 母液 Tris碱 冰乙酸 0.1M Na2EDTA·2H2O （pH8.0） 无菌水
● 6×DNA电泳上样液 母液 溴酚蓝 二甲苯氰 蔗糖水溶液 加入体积 终浓度 0.25% 0.25% 40%（W/V） 加入体积 12.1g 2.85ml 25ml 至50ml 终浓度 实验时，取1mL50×TAE电泳缓冲液母液，加49mL双蒸水稀释成1×TAE
● Gel Red贮存液
操作时应戴一次性手套
五、实验步骤
(一) 电泳前准备 准备内容 1.刷干净电泳制胶的梳子，板子，槽子，蒸馏水洗净晾干 2.检查电泳槽，根据情况更换缓冲液 作用 防止不必要的重复污染，减少外来的污染。梳子干净有利于梳孔的形成。 排除电泳槽的电极接触不良，确保缓冲液的缓冲能力，减少污染。 3.根据DNA的分离范围选择合适的胶浓达到较好的分离效果，防止样过快跑出胶或度并记录 4.计算琼脂糖的用量和制胶缓冲液的用量记录，胶最终越薄越好。 (二) 制胶 步骤 1.称量琼脂糖0.25g和1×TAE缓冲液25mL 注意事项 称量相对准确 加热时应盖上封口膜,以减少水份蒸发。非2.融胶，加热到胶产生大量的气泡时，常热，小心烫手，另外注意不要加热过度拿出摇匀，继续加热到完全溶解，拿出使胶冲出瓶子。因此注意选择起码为胶体摇匀，再加热到沸腾。 积2倍以上的瓶子。保证胶混匀和完全溶解，减少可能因此引起的胶中孔径不均匀者是过慢浪费时间。 实验记录备查
实验二质粒DNA的琼脂糖凝胶电泳
